A Necrose Hepatopancreática (NHP) do Litopenaeus vannamei

Caracterização e diagnóstico preliminar pelo método de Avaliação da Deterioração de Tecidos (ADT)

Por:
Patrício Bucheli – Consultor Contec Ltda.
e-mail: [email protected]
Jeandelynne Sampaio – Aquamaris Aquacultura S.A.
e-mail: [email protected]
Fernando Garcia – Consultor Contec Ltda.
e-mail: [email protected]
Marcos Carrera – Biólogo


A Necrose Hepatopancreática (NHP), é uma enfermidade causada por bactéria gram-negativa que afeta o trato digestivo dos camarões cultivados. Infecções por NHP têm causado sérios prejuízos econômicos na carcinicultura brasileira, principalmente em cultivos com condições ambientais inadequadas. O presente artigo descreve um procedimento de campo rápido, completo e altamente confiável no diagnóstico presuntivo e do nível de contaminação da Necrose Hepatopancreática em Litopenaeus vannamei. A base desta proposta se fundamenta em observações de campo na relação diagnóstico-tratamento-reversão que vem ocorrendo há um pouco menos de dois anos no Brasil e foi inicialmente desenvolvida e posta em prática em 1996. A prática e esforços locais em várias fazendas no Brasil têm permitido otimizar um sistema de classificação significativamente confiável, corroborado em observações histológicas, o qual confirma sua eficiência e praticidade. A técnica implica na avaliação da deterioração de tecidos dos túbulos hepatopancreáticos, mediante a preparação de amostras pela técnica de montagem em fresco (wet mount) e sua observação em microscopia direta. Este sistema de avaliação também tem permitido detectar NHP em pós-larvas de camarão tão pequenas quanto PL-5 ou 4mm, o qual sugere a possibilidade de incorporar esta técnica como outra ferramenta na seleção de pós-larvas.

Em 1985 ocorreu, pela primeira vez, um evento de mortalidade em fazendas camaroneiras no Estado do Texas (EUA), onde foram observados sinais clínicos característicos, incluindo mortalidades severas superiores a 90%. Os estudos iniciais, com a caracterização dos sinais clínicos e histopatológicos da enfermidade, foram realizados por Frelier (apud Johnson, 1989), tendo sido identificada como Hepatopancreatite Necrosante do Texas, ou TNHP, na sua sigla em inglês. Em 1992, Frelier e colaboradores mencionaram a existência de um agente bacteriano envolvido no quadro patológico, já que a oxitetraciclina incorporada na dieta, resultava em um incremento na sobrevivência e na produção. Essas pesquisas descrevem ainda os níveis de desenvolvimento da enfermidade levando em consideração a evolução de três sinais característicos: o número e extensão de células epiteliais dos túbulos hepatopancreáticos contendo bactérias, a inflamação intersticial dos túbulos e, finalmente, a extensão e cronicidade da necrose tubular.

Nesse mesmo ano, Lightner apresentou a estrutura morfológica do agente causador, e realizou estudos de ultraestrutura mostrando a natureza intracelular do agente responsável pelo NHP, qualificando-o como uma bactéria intracelular. Em finais de 1993, uma enfermidade com características clínicas e histológicas similares a TNHP foi diagnosticada em fazendas de cultivo do L. vannamei ao norte de Tumbes, no Peru. As técnicas aplicadas na identificação de NHP no Texas permitiram a confirmação de que o agente patogênico no Texas e no Peru eram os mesmos. Em 1996, Loy & Frelier apresentaram um probe (marcador) de DNA específico para o agente causador do NHP, obtido de um ensaio de hibridação in situ. Em 2004, Vincent demonstrou a transferência oral do agente etiológico em camarões sadios e afirmou que os sintomas da enfermidade produzidos por NHP já podem ser visíveis duas ou três semanas após a infecção. A partir de seus ensaios, Vincent estabeleceu que a mortalidade induzida por NHP é observada a partir do 18o até o 41o dia depois da exposição, não tendo sido observada nenhuma recuperação nos animais infectados. Foi observada também a presença de animais que toleraram a exposição ao agente patogênico, com resultados negativos na análise histológica. O estudo de Vicent mostrou também que o tempo médio de sobrevivência dos animais foi de 33,4 dias e que a taxa de mortalidade diária era de 5%. O tempo de incubação é, portanto, muito maior que o de algumas enfermidade virais, como WSSV (mancha branca) e TSV (Síndrome de Taura), como pode ser visto na tabela 1.

TABELA 1 – Comparação de TMS – Tempo Médio de Sobrevivência e TDM – Taxa Diária de Mortalidade, para três enfermidades em L. vannamei, adaptados de dados de Vincent (2004).
TABELA 1 – Comparação de TMS – Tempo Médio de Sobrevivência e TDM – Taxa Diária de Mortalidade, para três enfermidades em L. vannamei, adaptados de dados de Vincent (2004).

A distribuição da enfermidade está limitada aos países produtores do Ocidente, sem que, até o momento existam registros documentados de sua presença no Oriente. As seguintes espécies são conhecidas por serem hospedeiras de NHP: L. vannamei, L. setiferus, L. stylirostris, F. astecus e F. californiensis. Em decorrência do fato de, pelo menos até agora, não ser possível o cultivo do agente responsável pela NHP, as pesquisas dependem basicamente da permanência da enfermidade em animais vivos.

Agente Causador

A NHP é produzida por uma alpha-proteobactéria, pleomórfica (várias formas), gram-negativa, similar às Rickettsias. Morfologicamente é um bacilo que não apresenta flagelos, de 0,25 por 0,90 microns. Sua hélice contém oito flagelos apicais de 0,25 por 2-3,5 microns (Fig. 1). Sua replicação é citoplasmática, atacando, principalmente, o tecido do hepatopâncreas do camarão.

Figura 1 - Formas da bactéria de NHP. 10000X em  microscopia eletrônica. Adaptado de Ligthner (1999).
Figura 1 – Formas da bactéria de NHP. 10000X em  microscopia eletrônica. Adaptado de Ligthner (1999).
Histologia

Em cortes histológicos do tecido do hepatopâncreas afetado por NHP, observa-se que o mesmo encontra-se atrofiado, apresentando a mucosa dos túbulos com atrofias variando de moderada a extrema, além de lesões granulomatosas multifocais, relacionando um ou mais túbulos. As células epiteliais dos túbulos hepatopancreáticos, adjacentes às focis granulomatosas, encontram-se tipicamente atrofiadas com células columelares simples reduzidas a uma forma cuboidal em sua morfologia (Fig. 2). Se observa pouco ou nulo armazenamento de lipídios em vacúolos das células R e uma acentuada redução ou ausência de vacúolos secretores nas células B (Fig. 3).

Fig. 2 – Atrofia das células columelares dos túbulos  do hepatopâncreas, com presença de núcleos picnóticos.  150X. Adaptado de Ligthner (1999). NP – Núcleo picnótico
Fig. 2 – Atrofia das células columelares dos túbulos  do hepatopâncreas, com presença de núcleos picnóticos.  150X. Adaptado de Ligthner (1999). NP – Núcleo picnótico
Fig. 3 – Lúmen vazio em segmento apical dos  túbulos do hepatopâncreas. 40X em H&E. Adaptado  de Ligthner (1999). cB – Células B, cR – Células R, LU  – Lúmen, TI – Tecido intersticial, TE – Tecido epitelial
Fig. 3 – Lúmen vazio em segmento apical dos  túbulos do hepatopâncreas. 40X em H&E. Adaptado  de Ligthner (1999). cB – Células B, cR – Células R, LU  – Lúmen, TI – Tecido intersticial, TE – Tecido epitelial

As células epiteliais dos túbulos hepatopancreáticos, entre os focis granulomatosos, podem estar hipertrofiadas e conter massas de organismos basófilos, gram-negativos, tipo Rickettsia, livres no citoplasma. Os organismos são altamente pleomórficos e variam desde formas de bastão ou barra (0,3 – 9,0ìm) até formas helicoidais (0,2 x 2,6 – 2,9 ìm). As células infectadas podem mostrar núcleos normais ou picnóticos. Bactérias do tipo Vibrio costumam estar presentes como infecção secundária no lúmen dos túbulos em indivíduos severamente afetados.
Mencionam-se que as lesões de NHP em L. vannamei são histologicamente similares àquelas observadas em L. monodon e L. stylirostris quando são afetados pela enfermidade vermelha (red disease) ou na necrose hepatopancreática séptica e em peneídeos experimentalmente infectados com Aflatoxina B1.

Sinais Clínicos

Temos observado que a NHP pode afetar pré-juvenis em tanques berçários e até Pls de L. vannamei (a partir de 4mm) em laboratório. Em geral, os sinais clínicos podem ser resumidos da seguinte forma:

Nos viveiros de engorda:

1 – Anorexia, tratos digestivos vazios e redução da alimentação, afetando a taxa de conversão alimentar;
2 – Redução da taxa de crescimento por períodos maiores que quatro semanas, com caudas finas e uma baixa relação entre o peso e o comprimento;
3 – Mortalidade variando de moderada a alta intensidade. Ou, baixa mortalidade, porém constante, podendo atingir mais de 50% nos primeiros 30 dias, a partir do aparecimento dos sinais clínicos, quando os animais não foram submetidos a nenhum tratamento;
4 – Mudança de cor no hepatopâncreas, variando de vermelho intenso a esbranquiçado, com liquefação do mesmo;
5 – Necrose do hepatopâncreas;
6 – Acúmulo (infiltração) de hematócitos e possíveis quadros de necroses nos pleópodos e pereiópodos;
7 – Necrose branquial;
8 – Cutícula mole que não chega ao estado de pós-ecdise (pós-muda).

Nos Berçários:

1 – Desenvolvimento de populações com altas variações de comprimentos, possivelmente devido à baixa capacidade dos animais afetados em competir por alimento e espaço;
2 – Acentuada debilidade nos animais de pequeno porte;
3 – Baixa tolerância à testes de estresse (menos que 50%);
4 – Pós-larvas com tratos digestivos vazios;
5 – Não são observadas mortalidades nos tanques berçários;
6 – Histórico de baixas sobrevivências nos laboratórios de origem;
7 – Hepatopâncreas esbranquiçados, sem brilho, com poucos lipídeos, formato alongado e descolado do exoesqueleto.

Qualidade ambiental na evolução da NHP

Tem-se relatado, desde a aparição da NHP em cultivos, uma forte influência da temperatura e da salinidade (acima de 29oC e 20‰) na infectabilidade desta enfermidade. Sem dúvidas existem evidências desta enfermidade no Brasil em condicões muito mais amplas, como por exemplo no Rio Grande do Norte, com significativas mortalidades e infecções generalizadas em 27oC e 0,0‰ (Rio Ceará-Mirim), de acordo com nossas observações mais recentes.
Condições de qualidade ambiental caracterizadas por processos de eutrofização, têm sido frequentemente relacionadas com a maior sensibilidade do camarão ao patógeno. As variações bruscas no ambiente, devido a manejos em populações portadoras da bactéria, parecem acelerar o processo de incubação, favorecendo uma precoce expressão da enfermidade.

Avaliação da Deterioração de Tecidos

A técnica implica na avaliação da deterioração de tecidos dos túbulos hepatopancreáticos, mediante a preparação de amostras pela técnica de montagem em fresco (wet mount) e sua observação em microscopia direta nas objetivas de 4x, 10x e 40x. Às observações se aplicam uma qualificação correspondente ao grau de deterioração dos tecidos (score ADT). Tal qualificação deve ser empregada junto a outros argumentos técnicos na determinação do tratamento da enfermidade. As qualificações vão desde ADT I até ADT III, com várias implicações intermediárias de acordo com as observações realizadas. A observação da deterioração dos tecidos do hepatopâncreas inclui modificações estruturais de tecidos intersticiais e epiteliais dos túbulos.

Concomitantemente se incluem observações sobre o grau de degeneração funcional dos mesmos em sua capacidade para armazenar e manter certo nível de estabilidade nos lipídios que, posteriormente, serão utilizados como reserva energética, tanto no metabolismo basal como nos processos de crescimento do camarão. Este sistema de avaliação também tem permitido detectar NHP em pós-larvas de camarão tão pequenas quanto PL-5 ou 4mm, o qual sugere a possibilidade de incorporar esta técnica como outra ferramenta na seleção de pós-larvas.
Para a aplicação da técnica ADT é necessário apenas dispor de um microscópio óptico com objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x , lâmina e lamínulas e equipamentos para dissecção. Uma microcâmera de circuito fechado é opcional.

Coleta da Amostra

Durante a avaliação sistemática do estado de saúde dos camarões, uma coleta de 5-10 camarões por viveiro é considerada adequada na revisão da NHP (Lightner, 1996). com a experiência de campo, considera-se que, uma vez estabelecida a suspeita da enfermidade, é necessário coletar uma amostra selecionada de camarões para a análise, isto é, aqueles animais que mostram os sinais típicos. Uma vez caracterizada a doença, na avaliação rotineira, deve-se utilizar amostras tomadas aleatoriamente para acompanhar o desenvolvimento da enfermidade em cada viveiro.

As amostras, se possível, devem chegar vivas ao laboratório. Os camarões podem ser transportados em pequenas caixas de isopor ou bolsas plásticas com uma quantidade mínima de água para a sua avaliação imediata. Amostras de camarões mortos só podem ser analisadas se estes são mantidos em gelo no período de transporte ou armazenamento, por não mais de 30 minutos. Não são utilizadas amostras de camarões mortos que tenham sido mantidos por mais de 20 minutos em temperatura ambiente, pois o processo de decomposição é muito acelerado, observando-se a liquefação do hepatopâncreas nesse período de tempo.

Preparação de placa e análise de ADT

1 – Desinfecção externa do animal (álcool);
2 – Extração de uma porção do hepatopâncreas, cujo tamanho varia de acordo com o tamanho do camarão, mas o suficiente para evitar um acúmulo excessivo de tecido;
3 – Colocação de lamínula e aplicação de ligeira pressão na mesma para provocar a ruptura do tecido epitelial externo e a liberação e expansão do tecido tubular e da massa hepatopancreática na lâmina;
4 – Observação inicial a 4x para estimar o grau geral de infecção. Observa-se a abundância de lipídios, tecido epitelial tubular, coloração de fluidos lipídicos e estado do tecido intersticial;
5 – Observação a 10x para estimar com maiores detalhes a intensidade da inflamação intersticial dos túbulos e estado do tecido epitelial;
6 – Observações a 40x para verificar o estado das células no tecido intersticial. A observação das lesões é facilitada no hepatopâncreas de pós-larvas e pré-juvenis;
7 – Estimativa do grau de degeneração do tecido tubular externo;
8 – Observação do grau de deslocamento ou ausência de lipídios nos túbulos do hepatopâncreas;
9 – Qualificação das observações, de acordo com ao escore de ADT, de acordo com a seguinte tabela:

 

Tabela 2 - Qualificação do estado de deterioração de tecidos para análise presuntiva.
Tabela 2 – Qualificação do estado de deterioração de tecidos para análise presuntiva.

A valorização da pontuação da ADT é determinada da seguinte forma:

Para uma amostra de 10 camarões, cada indivíduo é qualificado de acordo com a pontuação de ADT. Os valores assinalados são somados e, posteriormente, é calculada a média, dando uma qualificação final para a amostra em particular, determinando-se o grau de infecção do viveiro de onde procede a amostra na tabela abaixo.

A prática tem demonstrado que devem ser considerados mecanismos de tratamento a curto prazo quando a população analisada apresenta um valor de ADT superior a 1,3. É necessário criar um critério que defina, para cada caso, o grau da relação entre a intensidade e a freqüência da infecção.

Paralelamente a esta avaliação, é indispensável o conhecimento detalhado da evolução da qualidade ambiental do viveiro e, em particular, deve-se analisar a presença de outros agentes patogênicos que possam estar afetando a população. Neste sentido, a decisão sobre os mecanismos de recuperação da saúde dos camarões será mais eficiente.

Fig. 4 - Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = I. Setas indicando a região apical.
Fig. 4 – Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = I. Setas indicando a região apical.
Fig. 5 - Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = II.
Fig. 5 – Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = II.
Fig. 6 - Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = IIIa
Fig. 6 – Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = IIIa
Fig. 7 - Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = IIIb.
Fig. 7 – Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = IIIb.
Fig. 8 - Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = IIIc.
Fig. 8 – Túbulos do hepatopâncreas em estado de ADT = IIIc.
Conclusões

A NHP é uma enfermidade com um alto poder de ação em más condições ambientais e das características físico-químicas da água nos viveiros de engorda de L. vannamei, e deve ser considerada no Brasil, bem como em outras regiões, como uma enfermidade de importância econômica.

A NHP não se limita à regiões com salinidades variando de moderadas a altas (> 10 ppt), mas também podem afetar cultivos em “águas doces” ou com baixas salinidades (< 3 ppt).

As características fisiológicas avaliadas em observações clínicas, têm demonstrado apresentar um notável grau de confiabilidade para detectar a presença da NHP em camarões de cultivo.

A avaliação microscópica realizada sobre o tecido do hepatopâncreas, caracterizada e medida em termos da Avaliação da Deterioração de Tecidos (ADT), tem demonstrado ser uma ferramenta de alta precisão e confiabilidade na detecção precoce da NHP em camarões cultivados, em particular, quando se considera o tempo que se requer para realizar esta análise, que não supera dez minutos para cada dez animais analisados.

Em várias fazendas do nordeste brasileiro, incluindo os Estados de Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Norte, este sistema de diagnóstico presuntivo tem sido introduzido com excelentes resultados, demonstrando significativas recuperações econômicas na produtividade das fazendas.

Tem-se reconhecido que a necessidade de se estabelecer sistemas de controles patológicos na produção deve dar-se em um esforço paralelo, com um reconhecimento maior sobre a qualidade do ambiente onde se produz camarão, especificamente, no relacionado com o comportamento químico, físico e microbiológico da água e do fundo dos viveiros. O entendimento e o manejo técnico podem permitir o controle de processos de deterioração ambiental que, normalmente, geram estresse no camarão, tornando-o mais suscetível a infecções como a NHP.

O desenvolvimento tecnológico na detecção e controle de enfermidades que afetam os cultivos, apesar de ser significativo em outros paises, se encontra em fase de crescimento que demanda maiores ferramentas para o setor produtivo brasileiro. Na atualidade conta-se com vários esforços na pesquisa em algumas regiões produtivas, onde se sobressaem os esforços realizados nas universidades de Santa Catarina e do Ceará, entre outras.