Por: Alberto J.P. Nunes, Ph.D. [email protected]
Pedro Carlos Martins, M.Sc., Doutorando Centro de
Diagnóstico de Enfermidades de Camarão Marinho
(Cedecam/Labomar/UFCedecam) Instituto de Ciências
do Mar/Universidade Federal do Ceará (LABOMARabomar)
[email protected]
No final dos anos 80 e na década de 90, as doenças infecciosas tiveram um efeito devastador no cultivo de camarão marinho, causando o colapso na produção de grandes países produtores e desencadeando perdas multimilionárias na indústria (Tab. 1). A partir de então, as enfermidades passaram a ser vistas como um obstáculo econômico e uma ameaça à viabilidade da atividade. Apesar de algumas destas doenças ocorrerem habitualmente em fazendas de cultivo no Brasil, seu impacto econômico não é considerado expressivo quando comparado a outros países. Contudo, estas infecções afetam consideravelmente o desempenho dos cultivos e causam alterações na aparência física dos camarões e conseqüentemente na qualidade do produto final. Este artigo fornece uma descrição das principais enfermidades que abatem a indústria de cultivo de camarão, seus sinais clínicos e as técnicas para monitorar e diagnosticar o estado de saúde da população cultivada.
As Enfermidades no Cultivo de Camarão Marinho
Na carcinicultura, enfermidade significa qualquer alteração adversa na saúde ou no desempenho de camarões ou populações de camarões cultivados. No cultivo, as enfermidades são desencadeadas quando ocorre um desequilíbrio entre as condições ambientais do viveiro, o estado de saúde dos camarões cultivados e os agentes potencialmente patogênicos. As enfermidades infecciosas são causadas por patógenos transmissíveis (vírus, bactérias, protozoários e fungos), enquanto as não infecciosas são resultantes de agentes abióticos (efeitos nutricionais, genéticos, ambientais e físicos). Sob uma situação de desequilíbrio no ambiente de cultivo, os camarões são submetidos a uma condição de estresse, gerando uma alteração em seu estado imunológico. Nestas circunstâncias, a população cultivada pode sofrer um ataque de patógenos levando os indivíduos a debilitação ou a morte.
Inúmeros fatores ambientais podem desencadear um processo infeccioso nos camarões marinhos. Temperaturas e pH extremos, baixas concentrações de oxigênio dissolvido, mudanças abruptas na salinidade e presença de substâncias tóxicas são elementos associados a um desequilíbrio no ambiente. A propagação de bactérias patógenas oportunistas (Vibrio spp., Aeromonas spp.), a proliferação de protozoários (Zoothamnium spp. e gregarinas), a captação de água contaminada, a aquisição de pós-larvas com alta carga viral e a presença excessiva de microalgas (dinoflagelados e cianofíceas) também geram efeitos deletérios na saúde dos camarões.
A implementação de procedimentos para diagnosticar o estado de saúde de camarões cultivados serve para detectar precocemente problemas no sistema de cultivo, como a presença de enfermidades, condições ambientais adversas ou ainda deficiências nutricionais e (ou) genéticas da população. Isto permite que ações sejam tomadas rapidamente para controlar, minimizar ou excluir os efeitos negativos de condições desfavoráveis sobre a produção de camarão, reduzindo os prejuízos financeiros resultantes da perda ou mau desempenho do estoque cultivado.
Anatomia Funcional dos Camarões e Sinais Clínicos de Enfermidades
Os camarões marinhos cultivados pertencem a família Penaeidae. Estes animais possuem o corpo comprimido e alongado, dividido em duas principais partes. O cefalotórax (cabeça) armazena os principais órgãos funcionais, como o coração, a glândula digestiva (hepatopâncreas), as brânquias e o estômago (Fig. 1). As estruturas de detecção, captura e manipulação do alimento são encontradas na região anterior ventral do cefalotórax.
O abdômen (cauda) é adaptado para o nado e subdividido em segmentos que se fundem ao cefalotórax. É na região ventral do abdômen onde estão localizadas as estruturas natatórias (pleópodos), o apêndice reprodutivo dos machos (petasma) e parte do cordão nervoso. Os principais órgãos e apêndices dos camarões e suas funções são apresentadas na tabela 2. Estas estruturas, quando expostas a agentes infecciosos, podem apresentar alterações funcionais ou lesões estruturais, gerando efeitos desde um retardamento no crescimento até o enfraquecimento e a morte do camarão.
Sinopse das Principais Doenças
As enfermidades na carcinicultura são categorizadas sob três níveis, baseando-se no seu nível de patogenicidade e perigo para a indústria de camarão (Fig. 2). A categoria 3 (C-3) envolve os patógenos que causam um mínimo impacto à produção, contudo podem gerar deformidades e alterações na aparência física dos camarões. Sob a categoria 2 (C-2) estão os patógenos que causam ameaça a produção, podendo afetar a produtividade dos cultivos e o crescimento e a sobrevivência dos camarões. A categoria 1 (C-1) inclui os patógenos que causam mortalidade em massa em populações cultivadas de camarões, representando uma ameaça a sobrevivência da indústria em uma determinada área geográfica. É nesta categoria onde está inclusa a maioria das doenças virais dos camarões marinhos.
IHHNV (Infecção Viral na Hipoderme e Necrose do Tecido Hematopoético)
O IHHNV é classificado como sendo um vírus da categoria C-1. Foi inicialmente observado em 1980 no Havaí, em populações cultivadas do Litopenaeus stylirostris. O IHHNV apresenta como principais sinais clínicos deformidades no rostrum, flagelo antenal enrugado, deformidades cuticulares e taxa de crescimento reduzida. No Litopenaeus vannamei, o IHHNV pode se manifestar através de animais nanicos com deformidades ao longo do corpo (RDS, “Runt Deformity Syndrome”). A transmissão do IHHNV pode ser vertical, durante o desenvolvimento embrionário, ou horizontal, através da ingestão de tecido infectado com o vírus e contato com água ou equipamentos contaminados. Não existe tratamento disponível para erradicação do IHHNV. Seu controle se dá através da aquisição de pós-larvas de boa procedência. Está presente no Brasil.
TSV (Vírus da Síndrome de Taura)
Desde 1992 o TSV já se manifestava em fazendas de camarão marinho no Equador. Inicialmente especulava-se a implicação de fungicidas e pesticidas utilizados em plantações de banana como causadores da enfermidade. Contudo em 1994, um vírus foi identificado como sendo o agente causador da Síndrome de Taura. O TSV foi responsável pelo colapso da indústria Equatoriana em 1993. Este vírus apresenta em sua fase aguda, camarões avermelhados em função da expansão de cromatóforos. Os camarões moribundos não conseguem completar o processo de muda, morrendo com o exoesqueleto ainda mole. Quando capturados vivos, os animais apresentam um comportamento letárgico, não se alimentam e estão próximos a morte. Na fase aguda, as mortalidades geralmente ocorrem entre 15 e 45 dias após a estocagem de pós-larvas no viveiro. A taxa diária de mortalidade pode alcançar 25%, restando no final entre 5% e 25% de sobreviventes. Na fase crônica da doença, os camarões conseguem sobreviver a muda, podendo apresentar comportamento ativo e alimentar-se normalmente. Neste estágio, os indivíduos infectados apresentam lesões e melanizações na cutícula, podendo sucumbir nos ciclos de muda subseqüentes. Algumas vezes apresentam cutícula mole e expansão avermelhada dos cromatóforos. Transmissão e controle semelhante ao IHHNV. Está presente no Brasil.
WSSV (Vírus da Mancha Branca)
Os primeiros relatos da ocorrência do WSSV ocorreram entre os anos de 1992 e 1993 em países do Nordeste asiático. A partir de então, o WSSV dispersou-se muito rapidamente nas principais regiões produtoras de camarão da Ásia. Em 1999, foi detectada a ocorrência do WSSV em diferentes países da América Central, inicialmente em Honduras e na Nicarágua e logo em seguida no Panamá e Equador. O diagnóstico do WSSV para as espécies asiáticas baseia-se em sinais macroscópicos, como a presença de manchas brancas cuticulares sobre o exoesqueleto. Estas manchas podem ser facilmente observadas a olho nu em casos mais avançados e são mais evidentes no Penaeus monodon devido a sua típica coloração escura. As manchas são depósitos excessivos de sais de cálcio na epiderme cuticular
No Litopenaeus vannamei o aparecimento de manchas brancas cuticulares pode não ocorrer ou não ser facilmente vistas a olho nu. Os sintomas da Mancha Branca se manifestam até que os camarões tenham atingido PL20 – PL21. Os principais sintomas da infecção são: (a) camarões letárgicos, exibindo um nado lento na superfície; (b) baixo consumo alimentar; (c) corpo com uma coloração rosada a pardo-avermelhado; (d) cauda vermelha associada à expansão de cromatóforos (condição similar àquela causada pelo TSV); (e) mortalidade de até 100% nos primeiros 3 a 10 dias após a exibição dos sinais clínicos; (f) morte de camarões no fundo dos viveiros, e; (g) manchas brancas de 0,5 mm a 2,0 mm de diâmetro no interior da superfície do exoesqueleto, resultante de um depósito anormal de sais de cálcio. Até hoje, não há relatos da presença do WSSV no Brasil.
NHP (Hepatopancreatite Necrosante)
O NHP é causado por bactérias gram-negativas e intracelulares, do grupo das Ricktesia que atacam o hepatopâncreas. Inicialmente, os camarões afetados pelo NHP podem apresentar um quadro clínico sem sintomas evidentes (assintomático). Em seguida, os camarões cessam a alimentação e o crescimento, exibindo um exoesqueleto amolecido. O trato digestivo apresenta-se sempre vazio com brânquias descoloradas e visíveis alterações no hepatopâncreas (esbranquiçado, reduzido e túbulos lesionados). As mortalidades acumuladas podem alcançar 50%. O NHP aparentemente não ocorre em salinidades inferiores a 10 ppt. É recomendada a implementação de métodos de detecção precoce e monitoramento contínuo do estoque cultivado para evitar e controlar o NHP. O NHP pode ocorrer em camarões cultivados no Brasil.
Vibrioses
Surtos de vibrioses são geralmente causados por um desequilíbrio na população das bactérias do gênero Vibrio que se encontram naturalmente nos ecossistemas estuarino e marinho. Entre as principais espécies do gênero que causam maiores prejuízos estão o Vibrio harveyi, V. vulnificus, V. parahaemolyticus e V. alginolyticus. As vibrioses são classificadas como infecções secundárias e oportunistas, atacando todos os estágios de vida do camarão (larval, pós-larval, juvenil e adulta). Problemas com vibriose ocorrem quando condições de estresse surgem no sistema de cultivo, tais como: (a) queda de oxigênio; (b) densidade de estocagem excessiva (super povoamento); (c) manuseio inapropriado do estoque (e.g., transferência, amostragem); (d) lesões na cutícula dos camarões; (e) subalimentação; e, (f) altas concentrações de compostos nitrogenados no ambiente de cultivo. O processo de infecção da vibriose pode ser cuticular, entérico (intestinal) e sistêmico (envolvendo vários órgãos). Quando localizada, apresenta lesões melanizadas na carapaça e (ou) abscessos pontuais no hepatopâncreas. O impacto da vibriose é variável, mas em alguns casos pode alcançar até 70% da população cultivada. Na vibriose crônica, camarões mortos ou moribundos podem ser canibalizados, rapidamente contaminando outros indivíduos na população.
Os camarões infectados internamente por víbrios apresentam sinais característicos quando estão próximos a morte. Estes sinais incluem: (a) fraqueza demasiada (camarões deitam no fundo do viveiro); (b) nado desorientado; (c) opacidade da musculatura abdominal; (d) aumento da pigmentação; (e) grampo na cauda (Fig. 3); e, (f) lesões escuras ou amarronzadas na cutícula. A ocorrência de vibriose é comum em fazendas de camarão no Brasil.
Variáveis da Produção como Indicador da Condição de Saúde
Uma série de parâmetros deve ser considerada quando o estado de saúde de camarões é avaliado na fazenda. Além da aparência física e comportamento dos animais, são também analisadas as variáveis de produção, as características populacionais do estoque cultivado e a qualidade dos parâmetros ambientais ao longo do cultivo. As estimativas da taxa de sobrevivência ou de mortalidade, o peso corporal e sua homogeneidade e a taxa de crescimento são os índices mais sensíveis a alterações adversas na condição saúde da população cultivada.
Taxa de Sobrevivência e Mortalidade
A sobrevivência é uma estimativa do número de camarões remanescentes no viveiro após a estocagem. Esta variável é expressa em termos percentuais (%) e é determinada dividindo o número de camarões vivos no viveiro pelo número de camarões vivos previamente estimado, multiplicando este resultado por 100. Aolongo do ciclo de produção, pode ser determinada a sobrevivência através de estimativas da demanda de ração nas bandejas de alimentação, pelo uso de redes de tarrafa ou por tabelas padronizadas de sobrevivência.
Geralmente os resultados finais de sobrevivência obtidos na despesca são empregados para projetar a taxa de sobrevivência da população em ciclos subseqüentes de engorda. Para isto, é necessário calcular o número total de camarões despescados, empregando os valores da biomassa e do peso médio individual dos camarões despescados (Fig. 4). Considerando que em 1 ha foi despescado 2.889 kg de camarão com 11,03 g, estima-se que um total de 261.922 camarões sobreviveu à engorda [2.889 ÷ (11,03 ÷ 1.000)]. Neste viveiro, foi povoado um total de 350.000 indivíduos, resultando em uma sobrevivência de 74,8% ao longo do ciclo de produção [(261.922 ÷ 350.000) x 100]. Extrapolando este resultado para o período total de engorda, teremos durante um ciclo de 84 dias, uma taxa de mortalidade diária de 0,3% [(100 – 74,8) ÷ 84]. A precisão deste método aumenta na medida em que são contabilizadas as variáveis de produção (ração, pós-larvas, qualidade de água, etc) e obtidos novos valores de sobrevivência final. De uma forma geral, os dados de sobrevivência alcançados para um determinado viveiro não deve ser extrapolado para outras unidades de produção, distintas épocas de engorda no ano e para diferentes fontes de pós-larva e tipos de ração. Uma classificação subjetiva para interpretar os resultados finais de sobrevivência de camarões é apresentada na tabela 4.
A taxa de sobrevivência da população não necessariamente é resultado direto da mortalidade de camarões. Fatores como escape, predação, contagem incorreta de pós-larvas no momento do povoamento, roubo ou estimativas imprecisas da sobrevivência podem contribuir para uma perda de camarão em viveiros. Portanto, taxa de sobrevivência somente significa o oposto de mortalidade se animais mortos puderem ser identificados no viveiro. Dentro do possível, a população deve ser amostrada através do uso de tarrafa para avaliação do seu estado de saúde ou ainda para detecção de camarões mortos ou moribundos no fundo do viveiro. Camarões mortos em bandejas de alimentação e (ou) a presença de aves próximas aos taludes do viveiro pode ser um indicativo de problemas no cultivo. Um pequeno cercado contendo um número conhecido de camarões pode auxiliar em estimativas da progressão e transmissão de doenças e avaliação das respostas a tratamentos ou outras manipulações do cultivo.
Peso Médio e Taxa de Crescimento
Alterações no peso médio dos camarões cultivados ao longo de um determinado período (taxa de crescimento) é um forte indicador da condição de saúde da população. A taxa de crescimento pode ser estimada semanalmente para cada unidade produtiva. A precisão das estimativas de crescimento da população depende do número de indivíduos contidos em cada amostra e do número de amostras pesadas. Geralmente é determinado o peso de três ou mais amostras contendo 50 indivíduos cada, coletadas aleatoriamente no viveiro por meio de uma tarrafa (Fig. 5). O número de camarões é contado em cada amostra e calculado o peso médio individual dos camarões capturados. A precisão da taxa de crescimento e peso médio pode ser melhorada através da medida do peso individual de cada camarão amostrado. Contudo, determinar o peso individual de grandes amostras de camarão é um processo laborioso para operações comerciais de cultivo e somente deve ser aplicado caso haja suspeita de problemas no estado de saúde da população.
A taxa de crescimento dos camarões é influenciada por fatores ambientais, genéticos, biológicos, nutricionais e de manejo. A temperatura da água, por exemplo, tem influência sobre as taxas sazonais de crescimento da população cultivada, afetando os ganhos semanais de peso dos camarões durante os meses mais quentes e frios do ano. Da mesma forma, densidades de estocagem mais elevadas podem resultar em taxas de crescimento mais reduzidas caso não seja dado o devido suporte nutricional. Os camarões também exibem menores taxas de crescimento na medida em que são alcançados pesos corporais mais elevados. Taxas de crescimento semanal entre 0,8 e 1,2 g são consideradas adequadas, contudo estes valores variam muito dependendo da qualidade da ração, localização da fazenda, sazonalidade e práticas de cultivo (Tab. 4). Resultados inferiores a 0,5 g por semana podem sugerir problemas de saúde na população. Dados de crescimento da população associados às estimativas de sobrevivência permitem calcular a biomassa estocada, informação que serve como subsídio para tomada de decisões relativas ao manejo e a despesca (Fig. 6).
Avaliação da Variação de Peso da População
A análise dos padrões de distribuição de peso corporal entre a população pode fornecer indícios da presença de enfermidades ou deficiências no manejo. Geralmente nestas situações, é observada uma grande distribuição de pesos entre a população cultivada. Para melhor compreender as causas das variações no peso médio dos camarões, deve ser plotado a distribuição de pesos da população amostrada e calculado o desvio padrão e o coeficiente de variação. Para determinar a distribuição de pesos entre a população, recomenda-se a coleta e pesagem individual de 100 a 200 camarões em uma balança de precisão, agrupando os resultados em um gráfico de acordo com a freqüência de ocorrência dos pesos encontrados (Fig. 7).
Enquanto o desvio padrão mede o nível de variação em uma determinada amostra, o coeficiente de variação compara esta variação em amostras que possuem diferentes valores médios. Se em um viveiro forem pesados cinco camarões com os pesos individuais de 11,5 g, 10,9 g, 12,4 g, 10,7 g e 12,8 g, a média destas amostras é de 11,7 g, o desvio padrão de 0,92 g e o coeficiente de variação equivalente a 18,4% [(desvio padrão ÷ média) x 100]. Normalmente o coeficiente de variação de populações cultivadas do Litopenaeus vannamei varia entre 10 e 20%. Valores superiores a 30% indica uma distribuição anormal de pesos, sugerindo a ocorrência de algum problema. Não é recomendado determinar de forma rotineira a distribuição de pesos de camarões saudáveis, exceto se for observada mortalidade no viveiro ou no momento da despesca (Fig. 8).
Ferramentas de Diagnóstico de Enfermidades
Para confirmação do estado de saúde da população, as avaliações empíricas apresentadas acima devem ser ratificadas por meio de métodos mais diretos e precisos para detecção e diagnóstico da enfermidade. Algumas destas técnicas podem ser implementadas na própria fazenda de cultivo, enquanto outras necessitam da infra-estrutura dos laboratórios especializados.
O diagnóstico de doenças infecciosas envolve a coleta de camarões que apresentam anomalias em seus aspectos externos ou de comportamento. Normalmente estes animais encontram-se próximos aos taludes dos viveiros, sendo facilmente capturados. Diversas ferramentas de diagnóstico podem ser utilizadas, variando de técnicas rápidas de campo até outras mais sofisticadas, tais como histologia convencional, microbiologia e biologia molecular. Para todas estas técnicas, é necessário que seja coletado animais vivos, de preferência moribundos e (ou) com sintomatologia externa (presença de necroses, deformidades no corpo, presença de manchas, etc.).
As técnicas de campo podem fornecer uma idéia do estado sanitário dos animais e em alguns casos, diagnóstico confirmatório de enfermidades em poucas horas. Em virtude de serem técnicas simples, podem ser conduzidas na própria fazenda. São necessários equipamentos como um microscópio com objetiva de 100x e ferramentas para dissecação dos camarões. Em alguns procedimentos, o camarão sobrevive ao exame (técnicas não destrutivas), enquanto em outros, o camarão necessita ser sacrificado para realização da análise (técnicas destrutivas). Na tabela 5 encontram-se as principais técnicas de campo, as anomalias e (ou) patógenos relacionados.
Indicadores Comportamentais e de Aparência Física
A avaliação da aparência física e comportamental dos camarões fornece informações importantes relativas a condição de saúde e desempenho do animal. Para isto, é necessário que se reconheça o camarão no seu estado normal de saúde, para servir como base comparativa. Alterações na aparência de alguns órgãos (brânquias, apêndices, cutícula do corpo, músculo abdominal e hepatopâncreas) pode fornecer de diagnósticos sugestivos a definitivos sobre algumas doenças. Um comportamento anormal pode servir de indicador do estágio inicial de uma determinada enfermidade.
Nas fazendas de camarão, as equipes de alimentação, qualidade de água e biometria devem ser devidamente orientadas e treinadas para observar alterações incomuns no comportamento e aparência física dos animais. As principais alterações comportamentais e mudanças na aparência física dos camarões associadas a possíveis problemas incluem: (a) dificuldade de muda; (b) nado errático na superfície e (ou) próximo aos taludes; (c) tempo prolongado de enterramento no fundo do viveiro; (d) demasiado comportamento migratório no viveiro; (e) concentração excessiva de camarões próximo aos taludes e comportas; (f) falta de apetite, camarão magro, com intestino e (ou) estômago vazios; (g) baixo nível de melanização (pigmentos) e alteração na coloração do corpo (Fig. 9A); (h) brânquias com presença de matéria orgânica (Fig. 9B); (i) urópodos (rabo) avermelhados; (j) necroses, erosões, manchas e (ou) lesões ao longo do corpo; (l) apêndices deteriorados ou quebrados; (m) presença de organismos comensais, deformidades no rostrum e ao longo do corpo (camarão torto); (n) nanismo; e, (o) estômago avermelhado e hepatopâncreas esbranquiçado (Fig. 9C).
Montagem Úmida
Assim como outras rotinas (análise dos parâmetros de qualidade de água, biometria), a montagem úmida das brânquias e do hepatopâncreas podem fazer parte do dia-a-dia das fazendas de camarão. Um dos indicadores mais sensíveis a condição geral de saúde dos camarões é o estado branquial. A partir do exame em microscópio de uma só lamela branquial pode-se detectar sinais de melanização, presença de bactérias filamentosas, protozoários ciliados, detritos ou algas. Os resultados do exame branquial são graduados numericamente e ordenados por grau de severidade (0 = ausente; 1 = muito leve; 2 = leve; 3 = média e 4 = grave). Um alto grau de incrustação branquial geralmente indica uma reduzida freqüência de muda e (ou) um alto nível de matéria orgânica na água do viveiro. Portanto, qualquer procedimento para induzir a muda (alta renovação, incremento alimentar, etc) geralmente reduzirá estas incrustações. Os filamentos brânquias melanizados podem ser causados por um grande número de agentes patógenos e substâncias tóxicas. Uma das causas mais comuns de brânquias negras é a toxicidade de amônia e nitrito.
Outro indicador sensível da saúde e nutrição dos camarões é o grau de vacuolização dos lipídios e deformação nos túbulos do hepatopâncreas. A montagem úmida do hepatopâncreas deve quantificar a concentração de vacúolos de lipídios e os túbulos deformados, obedecendo à mesma graduação numérica das brânquias. Em camarões saudáveis, os túbulos do hepatopâncreas devem estar preenchidos de vacúolos de lipídios (vacúolos = espaços cheios de líquidos). Pouca quantidade destes vacúolos pode ser causada por uma alimentação insuficiente, contaminações na água (e.g., pesticidas) ou enfermidades. Um dos principais sintomas do NHP (Hepatopancreatite Necrosante) é a reduzida quantidade de vacúolos. A montagem úmida das brânquias e do hepatopâncreas consiste basicamente em três passos conforme apresentado nas figuras 10 e 11.
Histologia Convencional
Outra técnica utilizada para estudar os diferentes tecidos e avaliar suas lesões é a histologia convencional. Na maioria dos casos é possível identificar o patógeno causador da lesão através das alterações no tecido e (ou) órgão afetado. Esta técnica fornece uma melhor qualidade de imagem dos tecidos, e em algumas ocasiões, sua utilização é necessária para diagnóstico da enfermidade. Os principais tecidos analisados nesta técnica são: brânquias, cordão nervoso, epitélio cuticular, estômago, glândula antenal, hepatopâncreas, intestino, órgão linfóide, tecido conjuntivo, tecido hematopoiético e cutículas. Desta forma, faz-se uma varredura com grande probabilidade de encontrar um dano nos principais sistemas funcionais do camarão. Seu grande inconveniente é o tempo requerido, custo e a necessidade de infra-estrutura especializada.
Para análise, deve-se usar camarões vivos com sinais de enfermidades. Os animais selecionados são injetados e submergidos em uma solução de Davidson. A solução de Davidson é tóxica por contato e inalação e deve ser manipulada com luvas, máscara e óculos protetores em zona ventilada. A composição de 1 litro de solução fixadora de Davidson é constituída de: (A) 330 mL de álcool etílico a 95%; (B) 220 mL de formalina 100% (37% – 39% formaldeído); (C) 115 mL de ácido acético glacial; e, (D) 335 mL de água destilada. Em animais maiores que 3 g, deve-se injetar um volume aproximado de solução pelo menos equivalente ao volume aproximado do seu corpo. Os seguintes pontos do camarão devem ser penetrados com a seringa contendo a solução: (A) diretamente no hepatopâncreas, e uma vez no lado esquerdo e uma vez no lado direito do órgão (Fig. 12); e, (B) no abdômen, na região do terceiro e último segmento e em ambos os lados.
Após a injeção, os camarões devem ser submersos em solução de Davidson durante 24 a 48 horas dependendo do tamanho do indivíduo. Um corte superficial na cutícula, sem penetrar o tecido, deve ser realizado em camarões maiores antes de submergir-los em Davidson. Em seguida, o animal é transferido para uma solução de etanol 50%, podendo ser enviado ao laboratório enrolado em papel toalha umedecido com álcool. É muito importante que o produtor execute perfeitamente esta etapa de fixação ou encaminhe animais vivos a um laboratório de histopatologia. Todas as amostras devem ser rotuladas com lápis, contendo as informações básicas do material (data da coleta, nome da fazenda, número do viveiro) a ser analisado e enviada em frasco limpo e bem fechado.
Bacteriologia
O controle da dinâmica populacional das bactérias no camarão e no viveiro é um importante indicador do início de um processo infeccioso no cultivo. Vários grupos classificados como bactérias oportunistas tornam-se patogênicos no momento de uma deficiência imunológica dos camarões. Um dos principais grupos oportunistas são as bactérias do gênero Vibrio (vibriose). Sua quantificação em uma amostra é realizada através do cultivo em placa de Petri com meio Agar TCBS. Através deste cultivo é possível avaliar o equilíbrio entre bactérias sacarose positiva (cor amarela) e sacarose negativa (cor verde). É importante frisar que a maior parte das bactérias, assim como os Vibrios, fazem parte da microbiota natural do ecossistema estuarino, onde geralmente estão instaladas as fazendas de cultivo de camarão marinho.
A suspeita de algum processo infeccioso causado por outros grupos de bactérias, diferente dos Vibrios, pode ser quantificada através do cultivo em placa com meios Agar marinho ou Agar PCA (3% NaCl). Além da análise quantitativa das bactérias totais e dos víbrios é possível identificar grupos específicos de colônias. Essa identificação pode ser realizada por métodos tradicionais de identificação bioquímica, os quais demandam muito tempo, ou através de kits de identificação do sistema API 20 E ou API 20 NE.
As avaliações bacteriológicas podem ser realizadas na própria fazenda de cultivo, desde que exista um local adequado para comportar os equipamentos necessários as análises. Geralmente é analisado o hepatopâncreas, a hemolinfa ou o camarão macerado. Caso o produtor não disponha de local apropriado, amostras de camarão vivo podem ser enviadas para laboratórios especializados. Os camarões devem chegar ao laboratório dentro de um prazo máximo de 8 horas, pois desta forma são evitados erros no diagnóstico.
Biologia Molecular
Diferente das técnicas que avaliam os tecidos dos camarões, as técnicas de biologia molecular são utilizadas para a detecção de patógenos. Em certas ocasiões, a presença do patógeno não significa que o animal está enfermo. Existem várias técnicas que utilizam ferramentas da biologia molecular para detecção de patógenos, entre elas pode-se citar:
(A) PCR (Reações de Polimerase em Cadeia): permite a detecção e amplificação do DNA do patógeno. Quando o DNA é amplificado, a sensibilidade para detecção tornar-se muito alta. O PCR pode ser realizado com uma ou duas etapas de amplificação, conseqüentemente aumentando milhares de vezes a sensibilidade da análise. O resultado pode ser obtido em poucas horas.
(B) RT-PCR: técnica que segue o mesmo princípio do PCR, porém permite a detecção e amplificação do RNA do patógeno. Isto é possível, pois se realiza um passo adicional onde se transforma o RNA em DNA. O resultado é também obtido em poucas horas.
(C) Hibridação in situ: técnica que combina os princípios da histologia com a detecção do DNA ou RNA do patógeno, sem entretanto realizar amplificações. O patógeno é detectado em uma lâmina de histologia. Fornece informações adicionais as técnicas de PCR, pois é possível localizar o patógeno e as lesões que o mesmo está causando. Devido ser uma técnica que exige muito trabalho e tempo, é utilizada principalmente em estudos científicos.
(D) Método de dot blot: utiliza o princípio de localizar o DNA do patógeno sendo executado em membranas de nitrocelulose, sem entretanto haver a necessidade de amplificações. Desta forma, constitue-se em um método simples de biologia molecular.
As técnicas de biologia molecular são úteis para detecção da presença de patógenos antes que se desenvolvam as enfermidades. Portanto, no caso de determinação da incidência de determinada enfermidade, é importante que a amostra da população seja estatisticamente representativa. Geralmente utiliza-se uma prevalência de 2% (porcentagem de animais infectados) com 95% de confiança, seguindo um tamanho amostral (Tab. 6).
Para aplicação das técnicas de biologia molecular, os camarões moribundos ou sob suspeita de enfermidade devem ser enviados ao laboratório vivos ou fixados em etanol 95% (não utilizar álcool de farmácia). Para os camarões juvenis e adultos, uma outra opção é remover um segmento branquial ou os pleópodos de cada indivíduo. Estas estruturas são acondicionadas juntas a fim de representarem a população estocada. No caso de larvas ou pós-larvas, pode-se coletar milhares de animais de diferentes pontos do tanque, juntá-los em um balde e girar a água do mesmo. Os animais que permanecem no fundo ou no centro do vasilhame devem ser amostrados, pois provavelmente são os animais mais debilitados. Caso os animais tenham sido lavados com alguma solução desinfetante, devem ser bem enxaguádos antes da fixação, pois alguns produtos químicos podem inibir a reação de PCR.
Conclusão e Perspectivas
Exames confirmatórios em laboratório fornecem um diagnóstico definitivo da doença. Contudo, estas análises devem também estar fundamentadas em sinais clínicos, nos padrões de comportamento ou mortalidade de camarões e nas variáveis ambientais e de produção. Através de técnicas rápidas de diagnóstico e das características de manifestação de cada doença é possível estabelecer um diagnóstico presumível, agilizando a tomada de decisões na fazenda e a implementação de medidas para contenção e (ou) exclusão da doença.
A mais bem sucedida das estratégias para o controle de doenças em fazendas de cultivo combina a prevenção por exclusão (biossegurança) e adoção de práticas saudáveis de manejo. É importante compreender que um único elemento do manejo não protege os estoques contra a reincidência de enfermidades, mas sim a unificação de um plano integrado de manejo para a manutenção de um sistema de cultivo ambientalmente saudável. O desenvolvimento de pós-larvas resistentes a patógenos específicos (SPF), o aperfeiçoamento de técnicas rápidas para o diagnóstico de enfermidades em camarões, a emergência dos sistemas fechados de cultivo e as inovações tecnológicas das rações balanceadas e probióticos prometem aumentar consideravelmente o estado de saúde de camarões e a integridade dos cultivos.
