Enfermidades da Carcinicultura Brasileira:

Métodos de diagnóstico e prevenção

Por:
Thales Passos de Andrade*1
Donald V. Lightner1
Itamar de Paiva Rocha2
1Aquaculture Pathology Laboratory, University of Arizona – USA,
e-mail: [email protected]
2Associação Brasileira dos Criadores de Camarão – ABCC


O Brasil dentre outros países produtores de camarão marinho em cativeiro tem enfrentado, nos últimos anos, vários impactos causados por enfermidades que contribuíram para a queda dos índices de desenvolvimento da carcinicultura. O risco do aparecimento de novas ou emergentes enfermidades sempre estará presente, porém, a dimensão do seu impacto dependerá da capacidade da indústria em controlar o grau de saúde dos camarões estocados. Diante deste quadro, é urgente a criação de uma força tarefa, com a participação de representações dos setores público e privado, visando estabelecer tecnologias que venham minimizar as perdas causadas por agentes patogênicos, como o vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) e da mancha branca (WSSV). A atuação desta força tarefa deverá ser eficientemente padronizada e coordenada pelos órgãos de gestão do setor, e ser implementada em fazendas e laboratórios regionais e nacionais.

O presente artigo tem por finalidade, destacar importantes conceitos, dados e ações que possuem o intuito de colaborar, de forma significativa, na prevenção de um possível prejuízo ocasionado pelas mortalidades apresentadas durante o ciclo produtivo do camarão L. vannamei no Brasil.

Principais agentes patogênicos importantes para a carcinicultura brasileira

Entre cinqüenta tipos de vírus que podem ser hospedeiros em crustáceos, um número superior a vinte pode infectar o camarão marinho. Apesar deste grande número, os produtores brasileiros devem ficar atentos ao controle de apenas quatro vírus: Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV), Vírus da Mancha Branca (WSV), Vírus da Infecção Hypodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV) – Tipo 1 e o Vírus causador da Síndrome de Taura – (TSV) – Tipo A. Acrescentam à lista de patógenos relevantes: um agente bacteriano causador da Necrose Hematopoiética (NHP) e um protozoário (gregarina). Todos estes patógenos são endêmicos e possuem histórico de terem gerado perdas no Brasil.

As espécies que pertencem ao gênero Okavirus: Vírus da Cabeça Amarela (YHV) e o Vírus Associado às Brânquias (GAV), apesar de não estarem presentes no Brasil, são exemplos de outros agentes virais que vêm causando perdas econômicas em outros países. Para prevenir a introdução desses patógenos na indústria brasileira, faz-se necessária a inclusão do trinômio YHV/GAV/LOV em programas de biossegurança que visam a importação. Adicionam-se à lista, o vírus australiano Morilan (MoV) e os serotipos B & C da Sindrome de Taura – (TSV). Pouco se sabe a respeito do Vírus do Crescimento Retardado em P. monodom (MSGV), causador de perdas financeiras em países asiáticos. Considerando que cinco espécies de camarão marinho são propícias para o cultivo no Brasil, justifica-se acrescentar o nome “MSGV” à lista de prevenção durante as negociações de importação de novas linhagens de L. vannamei (Tabela 1). 

Tabela 1. Patógenos com significativa importância para a carcinicultura brasileira. Adaptado das seguintes fontes: Office International of Epizoontias - OIE e U.S Marine Shrimp Farming Consortium (USMSFC).---------A: Patógenos endêmicos que podem causar perdas em uma ou mais espécies de camarão peneídeo. B: Patógenos que causam significantes doenças. C: Patógenos que causam doenças menos significantes e que podem ser erradicados. D: Patógenos que devem ter sua possível introdução no Brasil prevenida. a International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). * Listado pela OIE como uma doença que deve ser notificada a organização. ** Listada pela OIE como outras doenças que são significantes.
Tabela 1. Patógenos com significativa importância para a carcinicultura brasileira. Adaptado das seguintes fontes: Office International of Epizoontias – OIE e U.S Marine Shrimp Farming Consortium (USMSFC).———A: Patógenos endêmicos que podem causar perdas em uma ou mais espécies de camarão peneídeo. B: Patógenos que causam significantes doenças. C: Patógenos que causam doenças menos significantes e que podem ser erradicados. D: Patógenos que devem ter sua possível introdução no Brasil prevenida. a International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). * Listado pela OIE como uma doença que deve ser notificada a organização. ** Listada pela OIE como outras doenças que são significantes.
Métodos moleculares para a detecção dos agentes etiológicos

Todas as técnicas que vêm sendo empregadas no diagnóstico de doenças e controle das enfermidades no cultivo de camarão foram adaptadas das tradicionais técnicas conduzidas na histopatologia, virologia, bacteriologia e parasitologia. A utilização da cultura de células in vitro, satisfatoriamente usada no estudo de doenças humanas e na veterinária não foi estabelecida, até o momento, para o camarão. A ausência de linhagens de células específicas para o camarão, constitui-se a maior barreira para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico e para o progresso das pesquisas dos agentes patogênicos de interesse para o setor. Dessa maneira, todos os profissionais empenhados na elaboração de novas técnicas de diagnósticos para a carcinicultura, voltaram-se para adaptação de métodos moleculares utilizados na medicina veterinária e humana.

Atualmente, a aplicação de sondas genéticas e a reação em cadeia da polimerase, standard (1 passo), nested (2 passos) RT-PCR/PCR e real-time RT-PCR/PCR são as técnicas comumente utilizadas em laboratórios instalados em fazendas, unidades de produção de pós-larvas e centros de pesquisas em todo o mundo. Por exemplo, protocolos para hibridização in situ foram desenvolvidos para detectar seqüências genômicas virais: IHHNV, HPV, YHV, MBV, BPV, TSV, WSSV, IMNV e bacteriológicas: NHP, Ricketsia-like, Spiroplasma penaei, com resultados bastante satisfatórios. Para estas mesmas enfermidades foram adaptadas técnicas de PCR/RT-PCR, as quais são mais sensíveis e rápidas, que amplificam pequenas seqüências genômicas do agente, tornando-as um número tal, possível de ser detectado. Atualmente, o nested PCR/RT-PCR tem sido usado para selecionar reprodutores e verificar pós-larvas antecedendo a estocagem no cultivo. O fato é que apesar desta técnica ser realizada em dois passos, o resultado poderá ser falso-negativo caso o número de partículas virais presentes no camarão seja inferior ao limite possível de ser detectado. Desta maneira, surgiu a extrema necessidade de desenvolver uma ferramenta com uma sensibilidade mais alta, rapidez e confiabilidade. Esta ferramenta é o real-time PCR/RT-PCR, na qual é possível detectar menos do que dez cópias de fragmentos de RNA do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV). A aplicação do real-time PCR/RT-PCR vem também sendo utilizada como um mecanismo de validação para outros métodos moleculares. Com auxílio do real time foi possível verificar que o nested RT-PCR pode detectar a partir de 1000 cópias de IMNV-RNA em amostras de camarões infectados. Alguns outros indicadores de sensitividade de métodos moleculares de diagnósticos são apresentados na Tabela 2. As técnicas de PCR/RT-PCR exigem reagentes específicos, equipamentos caros e pessoal qualificado para o processamento das amostras até o resultado final.

 

Tabela 2: Números de cópias mínimas ml/RNA/DNA detectadas por métodos moleculares (RT-PCR/PCR) em amostras de camarões infectados*. (* sensitividade em análises clínicas é inferior a encontrada em amostras purificadas)
Tabela 2: Números de cópias mínimas ml/RNA/DNA detectadas por métodos moleculares (RT-PCR/PCR) em amostras de camarões infectados*. (* sensitividade em análises clínicas é inferior a encontrada em amostras purificadas)

O Escritório Internacional de Epizootias (OIE) da Organização Mundial de Saúde Animal atualiza as normas para o diagnóstico, prevenção e controle das doenças que causam perdas no cultivo do camarão anualmente. Acessando o website da OIE (www.oie.int) é possível conhecer os protocolos de hibridização in situ e PCR/RT-PCR, dos principais agentes supracitados.

Uma nova tecnologia de diagnóstico vem sendo lentamente adaptada para o diagnóstico das enfermidades de camarão. Conhecido na língua inglesa por Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), esta técnica já vem sendo utilizada para a detecção da AIDS, West Nile Virus, Tuberculose, gripe asiática, Salmonella e outros. No cenário da carcinicultura mundial, resultados satisfatórios foram obtidos na detecção de IHHNV e WSSV, trabalhos estes realizados por um grupo de pesquisadores chineses e japoneses respectivamente. Da mesma maneira, estudos já estão sendo iniciados pelo laboratório Aquaculture Pathology (UAZ/USA) para a adaptação da tecnologia, RT-LAMP, para o vírus da mionecrose infecciosa (IMNV). Após o período de desenvolvimento e validação, esta nova técnica deverá ser informada para a indústria.

LAMP possui a vantagem de gerar resultados em apenas uma hora, sem a ajuda de equipamentos caros como o termociclador, possibilitando um julgamento final possível a olho nu, mantendo a sensibilidade e especificidade do tradicional PCR/RT-PCR. Ao que tudo indica, LAMP e RT-LAMP serão duas outras siglas que o produtor terá que se acostumar nos próximos anos, além das já existentes (PCR, RT-PCR etc.). Essa técnica consiste da adição dos primers reagentes, enzimas e da alíquota do RNA/DNA extraído do camarão em um simples tubo que posteriormente será incubado isotermicamente (65ºC). A especificidade desta metodologia é garantida pela utilização de dois pares de primers internos e externos que reconhecem e amplificam seis diferentes regiões do genoma do agente. O produto resultado das amplificações é liberado na forma de magnésio pirofosfato, o qual tornará a cor da reação mais intensa em decorrência de seu acúmulo. Com a adição de um reagente fluorescente, o produto final poderá ser visualmente detectado. Existem outras técnicas para a interpretação desses resultados.

Alguns laboratórios preferem comprar os reagentes, enzimas e primers separadamente e produzir seus próprios controles positivo e negativo para a hibridização in situ e PCR/RT-PCR. Os que preferirem trabalhar com kits ready-to-go podem adquirir informações através dos sites: Intelligene (www.iq2000kit.com) e DiagXotics (www.diagxotics.com). A Applied Biosystems (www.appliedbiosystems.com) e Roche (www.roche-applied-science.com) são exemplos de empresas que comercializam os reagentes necessários para o real time. Todas as técnicas descritas acima representam o melhor método para diagnosticar enfermidades de camarões, portanto, além de serem recomendadas para a realização de diagnóstico clínico são recomendadas também para a seleção de estoques de camarões em programas de formação de linhagens livres de patógenos específicos (SPF) e linhagens resistentes a patógenos específicos (SPR).

Importação de novas linhagens e estabelecimento de um Centro de Seleção e Produção de Camarão (CSPC) SPF/SPR

A aquisição de novas linhagens genéticas de camarões marinhos, com o intuito de melhorar o desempenho das produções obtidas em fazendas de engorda e em laboratórios de produção de pós-larvas existentes no setor, torna-se importante. Desta forma, os benefícios obtidos com a importação de novas linhagens de reprodutores de L. vannamei irão refletir, a médio prazo, na competitividade global da indústria.

Já foram elaborados protocolos para assegurar a prevenção da introdução de novos patógenos ou doenças de camarões na indústria brasileira. Durante a entrada dos camarões no Brasil, será feito um rigoroso programa de quarentena antecedendo a liberação dos camarões para as unidades de produção existentes no setor. A instalação das unidades de quarentena terá por finalidade gerar condições para avaliar os novos estoques de camarões com o intuito de introduzir estes animais nos programas de melhoramento de reprodutores existentes no país e assim, evitar o surgimento de novos patógenos no setor. Após esta fase, para não haver uma nova necessidade de importação e garantir as características genéticas adquiridas, um Centro de Seleção e Produção de Camarão (CSPC) garantirá a produção contínua de SPF e o back up das linhagens genéticas no Brasil. O CSPC será o principal fornecedor de pós-larvas SPF para os Centros de Multiplicação (CM) cadastrados e para os centros de pesquisas (rato branco*). Os CMs fornecerão náuplios, pós-larvas e reprodutores High Health para os demais laboratórios de produção de pós-larvas e/ou fazendas de engorda.

Com a implantação deste novo esquema de produção, o Brasil será o segundo país no mundo a produzir camarão por meio de um altíssimo nível de biossegurança, e assim prevenir perdas econômicas decorrentes de enfermidade e/ou perda da qualidade genética. Diagramas mostrando as movimentações dos camarões, sob normas rígidas de biossegurança, durante a formação dos estoques SPF e SPR são demostrados nas Figuras 1 e 2.

Estabelecimento de uma rede de laboratórios de diagnóstico de referência para a indústria

No início de 2005, uma equipe do laboratório de referência mundial para enfermidades de camarões (Aquaculture Pathology Lab – UAZ/E.U.A) ministrou um curso sobre técnicas de diagnóstico aplicadas a patologias de camarões marinhos. Por iniciativa da ABCC e em parceria com a FINEP e UFRN, esse evento contou com a participação de 29 profissionais dos setores público e privado, os quais receberam atualizações sobre IMNV, WSSV, TSV, etc.

Dando continuidade aos trabalhos, recentemente, a ABCC e a Aquaculture Pathology (UAZ) realizaram um levantamento sobre os laboratórios de diagnósticos, público e privado, de enfermidades de camarão marinho que deram assistência para a carcinicultura marinha brasileira e/ou governo brasileiro no ano de 2005.

As informações foram levantadas com o intuito de serem usadas como base durante a elaboração de estratégias que permitam a formação de uma rede de laboratórios que possa apoiar a carcinicultura brasileira no controle de enfermidades relevantes para o país (i.e IMNV, WSSV, TSV, IHHNV e NHP), durante a formação de reprodutores livres ou resistentes a enfermidades etc. É importante destacar que esse trabalho não só fornece uma relevante informação para os associados da ABCC e demais interessados nesse tipo de assistência ao produtor, mas, também, é uma importante ferramenta a ser utilizada durante solicitações de apoio junto as representações do governo brasileiro, visando a operação desses laboratórios nas principais regiões produtoras do país.

Nove laboratórios foram identificados e convidados a participar do censo. Sete deles, localizados nos Estados do PI (1), RN (2), PE (2), SC (1) e RS (1) responderam a um questionário que solicitava informações sobre as características do laboratório, procedimentos realizados rotineiramente, reagentes e kits para métodos moleculares utilizados, validação e padronização do laboratório e por último, comentários e sugestões.

 

Figura 1 : Esquema de Importação e Produção de Linhagens SPF/HHS proposto para o Brasil.
Figura 1 : Esquema de Importação e Produção de Linhagens SPF/HHS proposto para o Brasil.

 

Figura 2: Esquema para produção de linhagens resistentes (SPR) ao IMNV (Andrade, T.P. D. et al., 2006)
Figura 2: Esquema para produção de linhagens resistentes (SPR) ao IMNV (Andrade, T.P. D. et al., 2006)

 

Dos laboratórios entrevistados 57% estão associados com as universidades ou instituições de pesquisas que realizam serviços para a indústria. Enquanto que 29% estão representados pelos laboratórios governamentais e 14% pelos privados. 86% dos laboratórios entrevistados usam o PCR/RT-PCR como a mais comum ferramenta para o diagnóstico do camarão marinho, seguida de análises de bacteriologia (71.43%) e histologia (42.86%) respectivamente. Apenas um laboratório, localizado no RN, está realizando a técnica de Hibridização in situ. Vale lembrar que a Hibridização in situ auxilia na confirmação de diagnósticos realizados por histologia e/ou PCR/RT-PCR e também apresenta-se como uma ferramenta necessária para o estudo do Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV) que ainda encontra-se em fase de descobertas.

No geral, 71% dos laboratórios realizaram o diagnóstico para IMNV, 86% de WSSV, 57% TSV, IHHNV (71%) e NHP (57%) por meio de PCR/RT-PCR. Adiciona-se a esta análise que um laboratório (PE) pode realizar o diagnóstico para YHV ou HPV para fins de pesquisa e, outros dois, (PI e SC) estão tentando implantar o serviço para detectar NHP.

Analisando os dados apresentados na tabela 3 é possível concluir que os Estados de SC, RN e PE, considerados importantes pólos de produção no país, podem realizar diagnóstico por meio de PCR/RT-PCR dos principais agentes de interesse para o Brasil (IMNV, WSSV, TSV, IHHNV). Por outro lado, levando em consideração os números da produção alcançados nos Estados do PI, BA, ES, CE, PB, SE, AL, PR, PA, RS e MA, observa-se que as fazendas e laboratórios de produção de pós-larvas presentes nestes Estados, estão ou podem estar, carentes deste tipo de assistência à produção. Desta maneira, sugere-se que os envolvidos em universidades, governo e empresas privadas busquem e estabeleçam unidades capazes (infra-estrutura e pessoal) de realizar diagnóstico das enfermidades de interesse para os produtores.

Para garantir o apoio ao produtor brasileiro no controle das enfermidades e na formação de camarões SPF/SPR, será necessário o estabelecimento de uma rede de laboratórios que estejam em harmonia com protocolos de diagnósticos usados na tecnologia PCR/RT-PCR e que forneçam resultados confiáveis para a indústria. Durante o censo, todos os laboratórios concordaram em receber amostras codificadas para serem testadas. Trabalhos já estão sendo iniciados para tentar viabilizar os recursos necessários para essa etapa de validação e padronização. Durante esta etapa, a medida que os laboratórios forem concluindo as análises satisfatoriamente, receberão uma comunicação escrita confirmando a credibilidade reconhecida pela diretoria da ABCC, materiais padronizando procedimentos e finalmente a informação será veiculada aos associados da ABCC. 

Vários juvenis infectados experimentalmente
Vários juvenis infectados experimentalmente
Estabelecimento de vigilância epidemiológica e formação de banco de dados

A consolidação da rede de laboratórios será tão importante quanto a formação e melhoramento de reprodutores SPF/SPR. Uma vez estabelecida, dar-se-á início ao programa de vigilância epidemiológica no Brasil. O sistema de apoio mútuo entre a ABCC e os laboratórios será fundamental para prevenir catástrofes como as que, por exemplo, ocorreram no Equador e na Tailândia, ambos sob impacto do virus da mancha branca. Sendo assim, mensalmente, os laboratórios membros irão reportar a lista constando os casos positivos diagnosticados para o setor de vigilância epidemiológica a ser estabelecido na ABCC (Figura 3). Deverão ser reportadas todas as enfermidades incluídas na Tabela 1 “Patógenos com significativa importância para a carcinicultura brasileira”. Uma vez de posse destes dados, o profissional encarregado na ABCC reunirá todos os relatórios mensais e redigirá um relatório geral final (sempre comparando com os meses anteriores) o qual após a análise da Diretoria Técnica da ABCC será repassado a todo o setor. Deverão ser incluídos ao relatório geral final os dados meteorológicos dos pólos de produção e finalmente tudo deverá ser disponibilizado no site da ABCC.

Em caso de detecção de algum pico epidêmico, o Diretor-Presidente da ABCC deverá contatar as autoridades competentes para controlar o problema imediatamente (i.e o Departamento de Defesa animal do Ministério da Agricultura) e garantir que todas as medidas cabíveis em apoio ao produtor e a sustentabilidade do setor sejam aplicadas. Após estes procedimentos, o profissional responsável pelo setor epidemiológico da ABCC, acompanhará as ações de controle e confeccionará relatórios de atualização para a diretoria da ABCC rotineiramente.

A medida que este programa for se consolidando, durante o censo anual realizado pela ABCC, serão determinadas as coordenadas em GPS dos pólos de produção e localização de laboratórios de produção de pós-larvas e reprodutores. A adição desses dados tornará possível elaborar mapas/relatórios para o sistema de vigilância epidemiológica da carcinicultura brasileira.

Produção nacional de ferramenta para o diagnóstico de IMNV

A efetiva aplicação das medidas expostas acima é dependente da utilização de ferramentas de diagnóstico que sejam possíveis de serem adquiridas rotineiramente no Brasil. Mesmo considerando que já existem no mercado internacional kits (in situ, PCR.) para o diagnóstico das principais enfermidades de interesse para a indústria, observa-se que muitos dos interessados estão encontrando dificuldades para aquisição desses kits. O custo de importação (valor dos kits+taxas) vem se apresentando como um grande fator limitante para viabilizar essas tecnologias para a indústria e pesquisadores brasileiros.
Durante a realização do censo foi constatado que um laboratório (PE) possui equipamento para sequenciamento de genes, sendo que 42.86% dos laboratórios entrevistados terceirizam este serviço e 57.14% não realizam sequenciamento de genes. Diante das dificuldades encontradas e a permanente necessidade de se diagnosticar o vírus da mionecrose infecciosa; recomenda-se que esforços sejam direcionados para a fabricação da versão IMNV nested RT-PCR brasileira dos kits de diagnósticos. Esta medida objetiva disponibilizar uma tecnologia de custo acessível e que possua um excelente padrão de qualidade, caracterizada por altas especificidade e sensibilidade, elementos imprescindíveis para o setor.

Tabela 3: Enfermidades possíveis de serem diagnosticadas por meio de PCR e/ou RT-PCR nos Estados produtores de camarão marinho 
Tabela 3: Enfermidades possíveis de serem diagnosticadas por meio de PCR e/ou RT-PCR nos Estados produtores de camarão marinho
Direcionamento de pesquisas básicas

O virus da mionecrose infecciosa ainda consiste em uma barreira para o desempenho do setor. No momento, acredita-se que as principais linhas de pesquisas a serem investigadas são:

a) Camarão transgênico: A organização mundial de saúde incentiva à manipulação genética para produção animal e vegetal. Considerando que não existem tratamentos efetivos para os períodos pós-infecção de viroses, recomenda-se estudos que envolvam manipulação e transferência de genes para possibilitar a produção de novas linhagens resistentes à infecção causada por IMNV. O Oceanic Institute (Hawaii/USA) em parceria com outras duas universidades americanas já vem desenvolvendo algumas pesquisas para a resistência a TSV.

b) Ferramentas de diagnóstico: A indústria está carente de ferramentas de diagnóstico, com um elevado nível de detecção para IMNV e outras enfermidades, que possam ser manipuladas em campo. A tecnologia Shrimple é um exemplo de diagnóstico de fácil manipulação, mas precisamos de algo mais sensível visto que essa tecnologia tem se mostrado 104 vezes menos sensível do que o PCR.

c) Resposta antiviral induzida por interferência genética: Recentes pesquisas mostraram um significante aumento da tolerância de camarões infectados por WSSV e TSV quando previamente inoculados com fragmentos de WSSV-dsRNA e TSV-dsRNA. Portanto, sugere-se que sejam feitas tentativas com IMNV e, caso os resultados mostrem-se satisfatórios, alternativas de produção e adição de moléculas de IMNV-dsRNA em rações de larvicultura e engorda devem ser investigadas.

d) Cultura de IMNV in vitro: O maior entrave para o estudo da mionecrose infecciosa deve-se a ausência de metodologias eficazes que possibilitem a cultura pura de IMNV por um longo tempo in vitro. Todos os estudos que necessitam partículas isoladas de vírus de camarão são conduzidos após amplificação do vírus em camarões vivos SPF. Este fato tem retardado o andamento de pesquisas no mundo inteiro. A cultura de diversas linhagens de células deve ser testada para agilizar o andamento de pesquisas.

e) Transmissão vertical: Existem registros que confirmam a transmissão vertical de enfermidades como GAV e IHHNV. Até o momento, é apenas especulativa a confirmação ou não da transmissão vertical do Vírus da Mionecrose Infecciosa. Sendo assim, a avaliação experimental da possibilidade de transmissão vertical deve ser colocada entre as prioridades de pesquisa.

Partículas purificadas por meio de microscopia eletronica (aceleracao 60KV, escala 50nm).
Partículas purificadas por meio de microscopia eletronica (aceleracao 60KV, escala 50nm).

 

* Nota do Autor: Rato branco ou white mice, é uma expressão utilizada por pesquisadores internacionais para designar uma linhagem genética conhecida e isenta de enfermidades, para ser usada em experimentos. No Brasil, os centros de pesquisa estão coletando camarões das fazendas para realizarem experimentos. Em geral, esses camarões estão com IHHNV, ou outra doença, que certamente interfere nos resultados finais.