Mancha Branca

A importância do diagnóstico histopatológico na avaliação do impacto e do prognóstico dessa doença nos cultivos de L. vannamei

Por:
Luis Alberto Romano e Adrián Marozzi
Centro de Biopatología Acuática
Buenos Aires – Argentina
e-mail: [email protected]


O cultivo de camarões tem sido praticado por séculos, em pequena escala, no litoral do Sudeste Asiático. A atividade industrial como observamos atualmente, se desenvolveu nos últimos 20 anos, tendo se tornado uma importante atividade econômica em muitos países do mundo. A partir da década de 70, a atividade cresceu de forma exponencial e, segundo a FAO (2003), somente em 2001 o setor mobilizou 7,9 bilhões de dólares. Os camarões, porém, são suscetíveis a vários patógenos (parasitas, fungos, rickettsias, bactérias e vírus) que geram enfermidades, muitas delas endêmicas e/ou pandêmicas, que causam perdas econômicas, provocadas pela acentuada diminuição da produção de camarões.

Em 1990, as perdas por enfermidades foram de aproximadamente 40% de toda a produção mundial, com um custo superior a 3 bilhões de dólares (Lundin, 1996). As enfermidades virais são, sem dúvida, as que têm gerado os maiores problemas na produção, sendo a Necrose Hipodérmica e Hematopoiética (IHNNV), a Síndrome de Taura (TSV), a Doença da Cabeça Amarela (YHV) e a Doença das Manchas Brancas (WSSV), as mais conhecidas.

Entre as enfermidades pandêmicas e endêmicas que desenvolveram ao redor do mundo, a Doença das Manchas Brancas é a mais importante no que se refere a perdas produtivas e econômicas. Os problemas socioeconômicos decorrentes desta enfermidade foram díspares em todo o mundo sendo que os países que mais sofreram seus efeitos negativos foram os em via de desenvolvimento, como o Equador.
Esse país, entre 1999 e 2000, ,o primeiro ano da enfermidade, perdeu 800 mil dólares, deixando 120 mil pessoas sem emprego. Na Ásia, em 1992, as perdas econômicas decorrentes do WSSV ficaram entre 4 e 6 bilhões de dólares. No mesmo ano, nas Américas, a mesma enfermidade causou prejuízos de mais de um bilhão de dólares (Lightner, 2005).

Para o diagnóstico da enfermidade causada pelo vírus WSSV (White Spot Síndrome Disease Vírus) podem ser utilizados vários métodos, entre eles o estudo histopatológico. No campo da certificação sanitária, como solicitado pela Organização Mundial de Sanidade Animal (OIE), os métodos confirmatórios são os moleculares, sendo a reação em cadeia da polimerase – PCR, o mais utilizado (Manual of diagnostic tests for aquatic animals. OIE. 2006).

O estudo histopatológico

São bastante conhecidas as diferenças entre as mortalidades médias observadas entre as diversas regiões de um mesmo país, em diferentes fazendas de uma mesma região, ou ainda, entre os distintos viveiros de uma mesma fazenda. Para tratar de estabelecer alguma resposta para este fato, avaliamos o papel do estudo histopatológico para o prognóstico evolutivo da enfermidade em uma população conhecida de L. vannamei.

Foram estudados 900 exemplares com esta enfermidade declarada e certificada com PCR, coletados em três fazendas no Equador, entre novembro de 2001 e novembro de 2003. Em uma delas, localizada na Província del Oro, foram povoados 124 hectares e coletadas amostras de três safras. Foram também coletadas amostras de três safras em outras duas outras fazendas localizadas na Província de Guayas, uma delas medindo 57 hectares e a outra 89 hectares. Por questões éticas, não serão mencionados os nomes dessas fazendas.
Os camarões foram coletados nas respectivas fazendas e a maioria nào tinha os sinais clínicos clássicos da enfermidade. Todos os camarões foram coletados entre 30 e 40 dia após o povoamento, de tal maneira que não tínhamos os dados da mortalidade ao final do ciclo. Foram fixados com solução de “Davidson”, injetada em vários pontos: lateralmente, no hepatopâncreas e nas regiões anterior e posterior do abdômen (Figura 1).

Pontos de fixação da solução de "Davidson"
Figura 1 – Pontos de fixação da solução de “Davidson”

Posteriormente, os animais foram submersos no mesmo fixador, em volume de 3:1 (três volumes de fixador para um de tecido a fixar).
Em seguida, todas as amostras foram processadas em um equipamento automático (Bavimed 2050) e sua inclusão foi feita em paraplas. É importante destacar que a orientação do tecido nos “cassetes” de processamento deve ser correta para poder visualizar corretamente os diferentes órgãos e tecidos. (Figura 2) Os blocos com as amostras foram cortados na espessura de 3 em um micrótomo Levca-M123. As sessões histológicas foram coloridas com Hematoxilina e Eosina, PAS, Tricromico de Masson, Reticulina de Gomori e Giemsa. As microfotografias foram tiradas com microscópio Olimpus B201 com sistema PM20.

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Em nosso laboratório, todo o material foi processado para estudos histológicos, tendo todo material tissular dos 900 animais sido revisado para avaliar o grau de comprometimento dos tecidos e órgãos, na tentativa de relacionar esses resultados com a variação dos percentuais de mortalidade. Vimos que, efetivamente, o percentual de mortalidade está relacionado com a severidade e extensão do vírus nos diversos tecidos.

Dados de povoamento e despesca

Na tabela 1 e no gráfico 1 se observa os dados do povoamento, densidade de larvas por hectare, duração do ciclo, sobrevivência e peso dos animais na despesca. Em todos os casos os viveiros foram povoados com larvas PL 12.

Dados de povoamento e despesca
Tabela I: Dados de povoamento e despesca

Resultado do estudo histopatológico.

Resultado do estudo histopatológico. Os nossos resultados histopatológicos foram similares aos descritos na literatura. Observamos corpos intranucleares de inclusão viral. Estes corpos, nas etapas iniciais da infecção se mostraram homogêneos e eosinófilos. Em alguns casos, nas lesões mais tardias, os corpos se mostraram basófilos (Fig. 3 e 4).

Podemos observar inclusões nucleares eosinófilas (flecha curta). Em alguns casos se observa “marginación” da cromatina (flecha longa). H-E X 40
Figura 3 – Podemos observar inclusões nucleares eosinófilas (flecha curta). Em alguns casos se observa “marginación” da cromatina (flecha longa). H-E X 40

 

Inclusões basófilas com núcleos homogêneos hipercromáticos (flecha curta) com setores de fragmentação celular (flecha longa). H-E 80 X
Figura 4 – Inclusões basófilas com núcleos homogêneos hipercromáticos (flecha curta) com setores de fragmentação celular (flecha longa). H-E 80 X

Esses tipos de alterações celulares foram encontradas nos seguintes tecidos e órgãos: estômago, brânquias, epiderme, hepatopâncreas, coração, órgão linfóide, tecido hematopoiético, glândula antenal, intestino, tecido nervoso e tecidos oculares. As alterações mais freqüentes foram observadas na epiderme, epitélio gástrico e brânquias (Figuras 5, 6, 7 e 8).

Cutícula e epitélio epidérmico com inclusões virais (flecha). H-H 40X
Figura 5 – Cutícula e epitélio epidérmico com inclusões virais (flecha). H-H 40X

 

Epitélio gástrico com múltiplas inclusões virais (flecha). H-H 40X
Figura 6 – Epitélio gástrico com múltiplas inclusões virais (flecha). H-H 40X
Corte tangencial do epitélio gástrico com múltiplas inclusões virais (flecha). H-H 60X
Figura 7 – Corte tangencial do epitélio gástrico com múltiplas inclusões virais (flecha). H-H 60X

 

Filamentos branquiais com inclusões virais (flecha). H-H 40X
Figura 8 – Filamentos branquiais com inclusões virais (flecha). H-H 40X

Foram comparadas a extensão das lesões tissulares e quantificamos os órgãos em que foram observadas lesões celulares por invasão viral. Na tabela 2 podemos observar a relação existente entre a mortalidade média (%) e o percentual de órgãos afetados. No gráfico 2 observamos a relação entre o percentual de mortalidade e a enfermidade “afección” de diversos tecidos.

Porcentagem de órgãos afetados
Tabela 2: Porcentagem de órgãos afetados

 

 

Relação entre porcentagem de mortalidade e tecidos afetados
Gráfico 2 – Relação entre porcentagem de mortalidade e tecidos afetados

Discussão

Está claro, sob o ponto de vista prático, que o PCR oferece diagnósticos seguros e com uma alta percentagem de efetividade. No entanto, trata-se de uma técnica qualitativa, pelo menos na maioria dos casos, e nos indica se o animal estudado é positivo ou negativo em relação a presença do material genético viral. Por outro lado, o grau de severidade das lesões, sua extensão e a análise da patogenia, sem dúvida, é muito melhor analisada através da histopatologia clássica e/ou molecular.

O diagnóstico histopatológico do WSSV é feito através da identificação de corpos intranucleares de inclusão viral, que se apresentam eosinófilos nas etapas iniciais da infecção, tornando-se basófilos mais tardiamente. São homogeneamente densos com hematoxilinina e eosina. As inclusões nucleares são positivas para Feulgen, da mesma forma que são positivas para a técnica de PAS. As células infectadas se caracterizam pela presença de núcleos hipercromáticos, com cromatina marginal, especialmente em células epiteliais do estômago e das brânquias, também podendo afetar a epiderme, hemócitos e células do tecido conectivo.

Em estados mais avançados de infecção se pode observar a desintegração do citoplasma celular, com pouca ou nenhuma resposta inflamatória (Inouye et al., 1994; Durand et al., 1996; Nunan e Lightner, 1997; Wang et al., 2002). Pode também se observar um tropismo viral para outros tecidos como hepatopâncreas, órgãos linfóides, glândula antenal, tecido muscular, pleópodos, tecido hematopoiético, coração, intestino, componentes do tecido nervoso, olhos e gônadas (Chang et al., 1996; Lo et al., 1997; Hameed et al., 1998; Kou et al., 1998).
Observamos uma relação diretamente proporcional entre a mortalidade e a quantidade de órgãos afetados pelo vírus. Efetivamente, pudemos ver que os animais provenientes da fazenda da Província del Oro, com um mortalidade média de 87,67% tinham afetados a maior parte dos órgãos, enquanto que os animais da Fazenda 2 da Província de Guayas, cuja mortalidade não superou os 34%, tinham comprometimento apenas do estômago, epiderme e brânquias.

O diagnóstico histopatológico não substitui as técnicas moleculares, mas as tiram do papel reducionista segundo o qual, ao nos depararmos com uma árvore, não temos como saber a dimensão do bosque. A técnica pela própria técnica é uma falácia. A técnica, o método, qualquer que seja, deve estar dirigido para um objetivo dentro de um sistema de diagnóstico protocolizado que permita que cada método de diagnóstico nos dê uma resposta para cada uma das diferentes perguntas que fazem os pesquisadores, e é de suma importância não descartar nenhuma técnica, somando todas para compreender em profundidade todos os aspectos de uma enfermidade como o WSSV.


Bibliografía
Chang, P. S., Lo, C. F., Wang, Y. C. and Kou, G. H. (1996). Identification of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in situ hybridization Dis. Aquat. Org. 27, 131-139.
Durand, S., Lightner, D. V., Nunan, L., Redman, R. M., Mari, J. and Bonami, J. R. (1996). Application of gene probes as diagnostic tools for White Spot Baculovirus (WSBV) of penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms 27, 59-66.
Food and Agriculture Organization. (2003). Fish Stat Plus: Universal software for fishery statistical time series. http://www.fao.org/fi/statist/FISOFT/FISHPLUS.asp
Hameed, A. S., Anilkumar, M., Raj, M. L. S. and Jayaraman, K. (1998). Studies on the pathogenicity of systemic ectodermal and mesodermal baculovirus and its detection in shrimp by immunological methods. Aquaculture 160, 31-45.
Inouye K., Miwa, S., Oseko, N., Nakano, K., and Kimura, T. (1994). Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus japonicus, in Japan in 1993: electron microscopic evidence of the causative virus. Fish Pathology 29, 149-158.
Kou, G. H., Peng, S. E., Chui, Y. L. and Lo, C. F. (1998). Tissue distribution of white spot syndrome virus in shrimp and crabs. In Advances in shrimp biotechnology, pp. 267-271. Edited by T. W. Flegel. Bangkok: National Center for Genetic Engineering and Biotechnology.
Lightner DV (2005). (Biosecurity in Shrimp Farming: Pathogen Exclusion through Use of SPF Stock and Routine Surveillance. Journal of the World Aquaculture 36: 229 – 248.
Lo, C. F., Ho, C. H., Chen, C. H., Liu, K. F., Chiu, Y. L., Yeh, P. Y., Peng, S. E., Hsu, H. C., Liu, H. C., Chang, C. F., Su, M. S., Wang, C. H. and Kou, G. H. (1997). Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive organs. Dis Aqua Org 30, 53-72.
Lundin, G. G. (1996). Global attempts to address shrimp disease. Marine/Environmental paper No. 4 Lard, water and Natural habitats Division. Environment Department. The World Bank Report, pp. 45.
Nunan, L. M. and Lightner, D. V. (1997). Development of a non radioactive gene probe by PCR for detection of white spot syndrome virus (WSSV). Journal of Virological Methods 63, 193-201.
OIE: Manual of diagnostic tests for aquatic animals, 2006.