Piscicultura marinha:

Instituto de Pesca consegue, de forma inédita, a crioconservação do sêmen da garoupa verdadeira

Por:
Eduardo Gomes Sanches1, Idili da Rocha Oliveira1, Pedro Serralheiro1, Sergio Ostini1 e Rodrigo Massao Tiba2
e-mail: [email protected]
1 Pesquisadores do Instituto de Pesca – Centro APTA do Pescado Marinho
2 Mestrando do Programa de Pós-Graduação do Instituto de Pesca


As águas brasileiras são extremamente favoráveis à piscicultura marinha em tanques-rede, porém, um dos maiores entraves para o desenvolvimento desses cultivos é a obtenção de alevinos, fato que se dá com a criação da garoupa verdadeira (Epinephelus marginatus), uma espécie que demonstra viabilidade econômica e grande potencial de produção. Diante disso, a crioconservação do sêmen da garoupa verdadeira, uma conquista inédita dos pesquisadores do Instituto de Pesca – SP, foi considerada um feito histórico para o desenvolvimento e a sustentabilidade da piscicultura marinha em nosso país, tanto pelo valor econômico deste peixe, como pelo seu potencial para cultivo, contribuindo decisivamente para o sucesso da reprodução desta espécie em cativeiro, que possibilitará a primeira produção de alevinos de garoupa no Brasil.

O litoral brasileiro dispõe de vastos recursos para propiciar o desenvolvimento da piscicultura marinha, entretanto, a oferta de alevinos é o que mais restringe este desenvolvimento (CERQUEIRA 2005). Corroborando com este autor, SANCHES et al. (2006) demonstrando a viabilidade econômica do cultivo da garoupa verdadeira (Epinephelus marginatus) em tanques-rede, afirmam que, apesar da região do litoral norte paulista e o litoral sul fluminense possuírem características geográficas de recorte em enseadas e com ilhas próximas ao continente, delimitando inúmeros ambientes naturais abrigados, que são extremamente favoráveis à criação de peixes em tanques-rede, um dos maiores entraves para este desenvolvimento tem sido a obtenção de alevinos de espécies com potencial de produção.

Este mesmo conceito é reforçado por COX et al. (2006) que afirmam ser a produção de larvas e alevinos essencial para o desenvolvimento e a sustentabilidade da piscicultura marinha.
Embora venham se apresentando como espécies aptas para o cultivo marinho, a reprodução dos serranídeos (família Serranidae, sub-família Epinephelinae), popularmente conhecidos como garoupas, badejos, meros e chernes, se reveste de uma maior complexidade em função de uma curiosa característica deste grupo. Os membros da subfamília Epinephelinae são hermafroditas protogínicos, ou seja, maturam inicialmente como fêmeas e em dado momento de seu desenvolvimento sofrem uma inversão sexual, definitiva, tornando-se machos (LIAO, 1993; ZABALA, 1997). A inversão sexual é reconhecida como uma estratégia reprodutiva de grande sucesso entre os peixes (BARREIROS, 1998) sendo que a iniciação deste processo é determinada por complexas interações sócio-demográficas (SHAPIRO, 1984).

Dada a complexidade desta estratégia reprodutiva, a obtenção de machos torna-se um problema para a realização da reprodução em cativeiro (TUCKER, 1994; SADOVY e COLIN, 1995; BARREIROS, 1998). A captura de machos, no ambiente natural, é extremamente difícil, por vários fatores: baixa ocorrência (os serranídeos formam haréns, poucos machos e muitas fêmeas), serem peixes de grande porte (dificuldades no manejo) e normalmente ocorrerem em profundidades abaixo dos 30 metros, tornando a captura complexa e com resultados baixos de sobrevivência.

Buscando alternativas para estas questões, diversos autores têm demonstrado a possibilidade da realização da inversão sexual de serranídeos em cativeiro, com a utilização de hormônios andrógenos (ROBERTS e SCHLIEDER, 1983; KUO et al., 1988; TAN-FERMIN et al., 1994; QUINITIO et al., 1997, 2001). Técnicas de inversão sexual têm sido utilizadas em várias espécies de serranídeos com resultados positivos. As mais empregadas consistem em realizar a inversão sexual baseada na ingestão de alimento tratado com o hormônio metiltestosterona (PANDIAN, 1995) ou, mais recentemente, com a utilização dos implantes de metiltestosterona (SARTER et al., 2006) ou, ainda, dos implantes de inibidores de aromatase (ALAM et al., 2006; LI et al., 2006). Estes tratamentos provocam o desenvolvimento dos testículos dos peixes, porém, seis meses após a interrupção da administração de andrógenos, os peixes retornam sua condição de fêmeas (CHAO e CHOW, 1990; MARINO, 2000), tornando o processo trabalhoso e de custo elevado. Embora possa parecer uma estratégia interessante, poucos trabalhos (WITHLER e LIM, 1982; CHAO et al., 1992; GWO, 1993; MIYAKI et al., 2005) têm enfocado a importância da crioconservação do sêmen destes peixes. A crioconservação do sêmen, portanto, dos peixes que sofreram inversão sexual, pode reduzir a complexidade deste processo, permitindo que o sêmen seja estocado, reduzindo a dificuldade e os custos na obtenção de machos para a reprodução dos serranídeos.

Desde o êxito alcançado por BLAXTER (1953) na hibridização de duas espécies de arenques, com períodos de desova separados sazonalmente, a importância do resfriamento como um recurso para preservar gametas ex situ, notadamente espermatozóides, é reconhecida em mais de 200 espécies, contribuindo significativamente para o controle da reprodução de espécies na piscicultura moderna (TIERCH, 2000). Segundo LUBZENS et al. (1997) a crioconservação pode acrescentar, ainda, outros benefícios, principalmente nos estudos de controle da reprodução de espécies hermafroditas protogínicas e de melhoramento genético de reprodutores, por meio das técnicas clássicas de seleção ou por meio da manipulação genética (triploidia, transgenia).

A técnica de crioconservação do sêmen, na reprodução de serranídeos, ainda é muito pouco utilizado nas regiões produtoras destes peixes (notadamente os países do Sudeste Asiático). Ainda permanece como prática tradicional nestas regiões a coleta de formas jovens na natureza para abastecer seus cultivos. A produção de alevinos, quando realizada, ocorre através da técnica da desova induzida e a obtenção dos machos é feita através dos processos de inversão sexual já descritos. Poucos relatos apontam a crioconservação como prática utilizada, provavelmente pelo não acesso à tecnologia e aos insumos, como por exemplo ao nitrogênio líquido.

O Instituto de Pesca, através de seus pesquisadores, vem, desde o início da década de 80, desenvolvendo a tecnologia de crioconservação de sêmen para diversas espécies de peixes marinhos e de água doce, tais como o pacu, o curimbatá, a truta, a tainha e o robalo, entre outras (FOGLI DA SILVEIRA et al., 1984; KAVAMOTO et al., 1986, 1989; SERRALHEIRO et al., 1998).

A definição de protocolos de crioconservação de sêmen da garoupa permitirá futuramente a criação de um banco de sêmen das diversas espécies de serranídeos, tornando desnecessária a prática de constantes processos de inversão sexual para a obtenção de machos. Este processo certamente irá se constituir em uma importante ferramenta para a conservação e produção comercial destas espécies.

A garoupa verdadeira

A garoupa verdadeira Epinephelus marginatus (Lowe, 1834), também conhecida em outros países como dusky grouper, é considerada por muitos autores como uma espécie importante do ponto de vista econômico e turístico, já que é grande o interesse por este peixe na pesca esportiva e no mergulho contemplativo. A garoupa é apontada como uma potencial candidata para a piscicultura marinha também no Brasil. Apesar de ser grande a ocorrência deste peixe em áreas rochosas do litoral na costa sudeste do país, poucos estudos foram realizados visando avaliar seu potencial de cultivo, entretanto, considerando sua biologia reprodutiva, diversos estudos já foram efetuados.

Segundo CHAUVET (1981), a inversão sexual da garoupa verdadeira ocorre a partir dos 16 anos de idade para um comprimento de 83 cm e um peso médio de 10,0 kg. BRUSLÉ (1985) concluiu que garoupas com peso inferior a 3,0 kg ainda são juvenis imaturos, sendo que fêmeas funcionais ocorrem na faixa de 3,0 a 9,0 kg. Acima de 9,0 kg a proporção de ocorrência de fêmeas diminui e a de machos aumenta. Este autor observou que a inversão sexual ocorreria em peixes com 9 a 10 anos de idade e 90 cm de comprimento.

As afirmações anteriores foram confirmadas por SPEDICATO et al. (1995) que avaliando um lote composto por 138 garoupas com peso entre 0,4 e 23 kg observaram a ocorrência de machos somente em peixes com peso superior a 13 kg. Já no Brasil, ANDRADE et al. (2003), observaram que a primeira maturação sexual da garoupa-verdadeira ocorre quando os indivíduos atingem cerca de 45 cm e 2kg (idade aproximada de 5 anos).

Reprodutor de garoupa verdadeira mantido em tanque-rede em Ubatuba/SP
Foto 1 – Reprodutor de garoupa verdadeira mantido em tanque-rede em Ubatuba/SP
A pesquisa do Instituto de Pesca

Desenvolvendo o projeto “Indução da inversão sexual da garoupa-verdadeira com o uso de hormônio masculinizante e crioconservação do sêmen” a equipe de pesquisadores do Instituto de Pesca – APTA – SP , conseguiu, em dezembro de 2006, obter e criopreservar de forma inédita no Brasil, o sêmen da garoupa verdadeira. Este feito, considerado histórico para a piscicultura marinha brasileira, tanto pelo valor econômico deste serranídeo como por seu potencial para cultivo, irá contribuir decisivamente para o sucesso da reprodução desta espécie em cativeiro, possibilitando a primeira produção de alevinos de garoupa no Brasil.

A captura de um grande exemplar macho (Foto 1) permitiu a realização do primeiro processo de crioconservação de sêmen, extraído após leve pressão manual do abdomen (Foto 2), sendo colhido com o auxílio de seringas plásticas.

Procedimento de coleta de sêmen em garoupa verdadeira
Foto 2 – Procedimento de coleta de  sêmen em garoupa verdadeira

O emprego das seringas permite eliminar uma eventual contaminação do sêmen com fezes, sangue e principalmente com urina. O sêmen foi analisado sob o aspecto qualitativo, determinando-se os parâmetros de motilidade espermática (porcentagem de células da amostra que apresentam movimento), tempo da motilidade espermática (duração da atividade de movimento celular, em segundos) e concentração espermática (número de espermatozóides/mL) do sêmen fresco.

Somente sêmen com motilidade espermática superior a 90% é utilizado para o congelamento, sendo misturado ao diluente e ao crioprotetor e colocado em palhetas plásticas (Foto 3) seladas com álcool polivinílico, onde permanecerão em um botijão criogênico (Foto 4) contendo nitrogênio líquido (-196ºC).

Botijões onde o sêmen permanece armazenado em nitrogênio líquido (-196°C)
Foto 3– Botijões onde o sêmen permanece armazenado  em nitrogênio líquido (-196°C)

Pretendendo-se utilizar este sêmen no processo de reprodução, as palhetas deverão ser descongeladas em água (27ºC), durante 2 a 3 minutos e, em seguida é realizada a aferição da motilidade e do tempo de motilidade espermáticos e então utilizadas para a fecundação dos ovócitos.

Palhetas plásticas onde o sêmen é conservado
Foto 4 – Palhetas plásticas onde o sêmen é conservado

Com a quantidade de sêmen obtida, também foram realizados diversos experimentos visando avaliar os fatores que influenciam o processo de crioconservação, tais como: a composição do criodiluidor, a velocidade de congelamento, a proporção de diluição do sêmen, a concentração de crioprotetor, e o efeito do tempo da combinação do sêmen com a mistura do diluente e crioprotetor. Os resultados destes experimentos possibilitarão a definição de um protocolo de crioconservação para o sêmen da garoupa verdadeira. A equipe de pesquisadores espera realizar os primeiros ensaios de reprodução induzida, já utilizando o sêmen crioconservado, no início de 2007 e acredita que obterá os primeiros alevinos já no primeiro trimestre do ano.

Imagem dos espermatozóides de E. marginatus (aumento 200 X)
Imagem dos espermatozóides de E. marginatus (aumento 200 X)

Paralelamente a isso, um total de 24 garoupas verdadeiras fêmeas, com peso médio de 2 a 3 kg, divididas em três lotes, vêm recebendo alimentação diária com hormônio masculinizante, já que ainda não estão sendo utilizados os processo de implantes. A coleta de sêmen destes peixes deverá ser iniciada em fevereiro de 2007, visto que o processo de inversão sexual em condições de cativeiro leva em média cinco meses.


A equipe do Instituto de Pesca contou com a colaboração de Luigi Liberatti


Referência bibliográfica
ALAM, M.A.; BHANDARI, R.K.; KOBAYASHI, Y.; SOYANO, K. and NAKAMURA, M. Induction of sex change within two full moons during breeding season and spawning in grouper. Aquaculture, v. 255, p. 532-535, 2006.
ANDRADE, A.B.; MACHADO, L.F.; HOSTIM-SILVA, M. and BARREIROS, J.P. Reproductive biology of the Dusky grouper Epinephelus marginatus (LOWE, 1834). Brazilian Arch.Biol. Tech. Vol. 46, n 3, p 373-381. 2003.
BARREIROS, J. P. Sexual inversion in Epinephelus marginatus (Lowe, 1834) (Pisces: Serranidae, Epinephelinae) nos Açores. Revista Portuguesa de Zootecnia, v.5, n.1, p. 81-90, 1998.
BLAXTER, J.H.S. Sperm storage and cross-fertilization of spring and autumn spawning herring. Nature, v. 172, p. 1189-1190, 1953.
BRUSLÉ, J. Esposé synoptique des données biologiques sur les mérous Epinephelus aeneus (Geoffroy Saint Hilaire, 1809) et Epinephelus guaza (Linnaeus, 1758) de L`Océan Atlantic et de la Méditerranée, FAO Synop. Pêches, v. 129, 64p., 1985.
CERQUEIRA, V.R. Cultivo de peixes marinhos. In: BALDISSEROTO, B. e GOMES, L.L. (ed) 2005. Espécies nativas para piscicultura no Brasil. Editora UFSM. Santa Maria/RS. 2005. p. 369-406.
CHAO, N.H.; TSAI, H.P. and LIAO. I.C. Short and long-term cryopreservation of sperm and sperm suspension of the grouper, Epinephelus malabaricus (Bloch and Schneider). Asian Fisheries Science, v. 5, p. 103-116, 1992.
CHAO, T. and CHOW, M. Effect of methyl testosterone on gonadal development of Epinephelus tauvina (Forskal). Singapore Journal of Primary Industries, v. 18, p. 1-14, 1990.
CHAUVET, C. Calcul par otolimetrie de la relation long t – age d Epinephelus guaza (L. 1758) de la Cote Nord de la Tunisie. Rapp. Comm. Int. Mer Médit. v. 27, p. 103-106, 1981.
COX, E.; FRY, P. and JOHNSTON, A. Mesocosm technology advances grouper culture in northern Australia. Aquaculture Asia Magazine, Jan-Mar, p. 34-36, 2006.
FOGLI DA SILVEIRA, W.; KAVAMOTO, E.T.; RIGOLINO, M.G.; PENTEADO, L.A. E CARVALHO FILHO, A. C. Primeiros resultados de fertilização com sêmen congelado da truta arco-íris, Salmo irideus Gibbons, no Brasil. Boletim do Instituto de Pesca, v. 11, p. 131-136, 1984.
GWO, J.C. Cryopreservation of black grouper (Epinephelus malabaricus) spermatozoa. Theriogenology, v. 39, p. 1331-1342, 1993.
KAVAMOTO, E.T.; FOGLI DA SILVEIRA, W. e GODINHO, H. M. Caracterísiticas seminais do curimbatá, Prochilodus scrofa, Steindachner, 1881. Boletim do Instituto de Pesca, v. 13, n. 2, p. 45-50, 1986.
KAVAMOTO, E.T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H. M. e ROMAGOSA, E. Fertilização em Prochilodus scrofa, Steindachner, 1881, com sêmen crioconservado em nitrogênio líquido. Boletim do Instituto de Pesca, v. 16, n. 1, p. 29-36, 1989.
KUO, C.M.; TING, Y.Y.; YEH, S.L. Induced sex reversal and spawning of blue-spotted grouper Epinephelus fario. Aquaculture, v. 74, p. 113-126, 1988.
LI, G.L.; LIU, X.C.; ZHANG, Y. and LIN, H.R. Gonadal development, aromatase activity and p450 aromatase gene espression during sex inversion of protogynous red-spotted grouper Epinephelus akaara (Termminck and Schlegel) after implantation of the aromatase inhibitor, fadrozole. Aquaculture Research, v. 37, n.5, p. 484-491, 2006.
LIAO, I. C. Finfish hatcheries in Taiwan. In: Lee, C. S.; Su, M. S. and Liao, I. C. (ed.). Finfish hatchery in Asia: proceedings of finfish hatchery in Asia 91. Tungkang Marine Laboratory, Taiwan Fisheries Research Institute. p 1-25. 1993.
LUBZENS, E.; DAUBE, N.; PEKARSDY, I.; MAGNUS,Y. COHEN, A. YUSEFOVICH, F.; FEIGIN, P. Carp (Cyprinus carpio L.) spermatozoa cryobanks: Strategies in research and application. Aquaculture, v. 155, p. 13-30, 1997.
MARINO, G.; AZZURRO, E.; FINOIA, M.G.; MESSINA, M.T.; MASSARI, A. e MANDICH, A. Recent advances in induced breeding of the dusky grouper Epinephelus marginatus (Lowe, 1834). Cahiers Options Mediterraneennes. CIHEAM, v.47, p.215-226, 2000.
MIYAKI, K.; NAKANO, S.; OHTA, H. and KUROKURA, H. Cryopreservation of kelp grouper (Epinephelus moara) sperm using only a trehalose solution. Fisheries Science, v. 71, p. 457-458, 2005.
PANDIAN, T. J. and SHEELA, S.G. Hormonal induction of sex reversal in fish. Aquaculture, v. 138, p. 1-22, 1995.
QUINITIO, G.F.; CABEROY, N.D.; REYES JR, D.M. Induction of sex change in female Epinephelus coioides by social control. Isr. J. Aquac., v. 49, p. 77-83, 1997.
QUINITIO, G.F.; TAN-FERMIN, J.D. Possible application of mibolerone for induced sex inversion of grouper Epinephelus coioides. Fish. Sci., v. 67, p. 232-237, 2001.
ROBERTS, D. E. JR. and SCHLIEDER, R. A. Induced sex inversion, maturation, spawning and embriogeny of the protogynous grouper, Mycteroperca microlepis. J. World Maricul. Soc. v.14, p. 639-649, 1983.
SADOVY, Y.; COLIN, P.L. Sexual development and sexuality in the Nassau grouper. J. Fish Biol., v. 46, p. 961-976, 1995.
SANCHES, E.G.; HENRIQUES, M.B. e FAGUNDES, L. Viabilidade econômica do cultivo da garoupa verdadeira (Epinephelus marginatus) em tanques-rede, região Sudeste do Brasil. Informações Econômicas, SP, v. 36, n.8, 2006.
SARTER, K.; PAPADAKI, M.; ZANUY, S. and Mylonas, C.C. Permanent sex inversion in 1-year-old juveniles of the protogynous dusky grouper (Epinephelus marginatus) using controlled-release 17-a-methyltestosterone implants. Aquaculture, v. 256, p. 443-456. 2006.
SERRALHEIRO, P.C.S.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H.M.; OLIVEIRA, I.R. E PIMENTEL, C.M.M. Fertilização em robalo Centropomus parallelus (Poey, 1860) com sêmen crioconservado. In: Congresso da Associação Brasileira de Aqüicultura (Aquicultura Brasil 98). 1., 1998, Recife. Anais … Recife/PE, 1998, p. 290.
SHAPIRO, D. Sex reversal and sociodemografic processes in coral reef fishes. In: G. W. Potts e R. J. Wootton (ed.) Fish Reproduction: strategies and tacties. Academic Press. London. 1984.
SPEDICATO, M.T.; LEMBO, G.; DI MARCO, P. e MARINO, G. Preliminary results in teh breeding of dusky grouper Epinephelus marginatus (Lowe, 1834). Cah. Options Méditerr., v. 16, p. 131-148, 1995.
TAN-FERMIN, J.D.; GARCIA, I.M.B.; CASTILLO JR, A.R. Induction of sex inversion in juvenile grouper Epinephelus suillus, (Valenciennes) by injections of 17-alfa-metiltestosterone. Jpn. J. Ichthyol., v.40, p. 413-420, 1994.
TIERSCH, T.R. 2000 Introduction. In: Cryopreservation in Aquatic Species. Word Aquaculture Society. Tierch, T.R. and Mazur, P.M. eds. Baton Rouge, Louisiana. USA: xix-xxvi.
TUCKER, J.W. Spawning by captive serranid fishes: a review. Journal of the World Mariculture Society v.25, n.3, p. 345-359, 1994.
WITHLER, F.C. and LIM, L.C. Preliminary observations of chilled and deep-frozen storage of grouper (Epinephelus tauvina) sperm. Aquaculture, v. 37, p. 389-392, 1982.
ZABALA, M.; GARCIA-RUBIES, A.; LOUISY, P. and SALA, E. Spawning behavior of the Mediterranean dusky grouper Epinephelus marginatus (LOWE, 1834) (Pisces, Serranidae) in the Medes Islands Marine Reserve (NW Mediterranean, Spain). Scientia Marina, v. 61, n.1, p. 65-77, 1997.