Por: Pedro Carlos Cunha Martins
Cedecam/Labomar/UFC
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As técnicas para o diagnóstico do vírus da mancha branca (WSSV) podem ser divididas em histológicas, que se baseiam no estudo dos tecidos e avaliações das lesões presentes nos mesmos, e nas técnicas moleculares que são utilizadas para a detecção do patógeno, algumas vezes não significando que o animal esteja doente.
A maioria dessas técnicas necessita de equipamentos e/ou pessoal treinado para sua execução. Entretanto, diante da presença do WSSV no Brasil, torna-se necessário o conhecimento por parte dos produtores, de ferramentas simples que o auxiliem no processo de tomada de decisões diante de um novo cenário. Portanto, nesse momento, a técnica para coloração rápida de brânquias para detecção do WSSV, se constitui em uma ferramenta que deve ser utilizada no manejo preventivo dos viveiros. Esta técnica permite identificar as lesões causadas pelo vírus da mancha branca bem como outras alterações.
Todo o procedimento de análise se realiza em um tubo Eppendorf ou outro frasco pequeno que torne possível o trabalho com os reagentes químicos. Para diagnosticar esse processo patológico é necessário coletar animais que apresentem anomalias externas ou comportamentais. Normalmente, estes animais se encontram na superfície e bordas dos viveiros. Só deverão ser coletados animais vivos e/ou moribundos.
A técnica consiste, inicialmente, na coleta de uma amostra das brânquias e colocação da mesma em um tubo com fixador Davidson-HCl (substituir o ácido acético por HCl a 50%) por um período mínimo de uma hora. Desta forma, o processo de fixação do tecido das brânquias é realizado.
Em seguida, é necessário lavar com água corrente durante 15 minutos (cobrir a boca do tubo com uma gaze ou malha para que o tecido não saia de dentro do tubo). Passado esse tempo, o tubo é esvaziado. Após a lavagem, a seqüência de banhos nas brânquias dentro do tubo é realizada:
| • adicionar hematoxilina durante 10 min. e esvaziar; • lavar com água corrente em movimento durante 15 minutos e esvaziar; • adicionar eosina durante 2 minutos e esvaziar; • adicionar etanol 95% durante 1 min., esvaziar e repetir 2 vezes mais; • adicionar etanol 100% durante 1 min., esvaziar e repetir 2 vezes mais; • adicionar xilol durante 30 segundos, esvaziar e repetir 2 vezes mais. • manter em xilol até que se monte a lâmina com a lamínula e entelan. O material poderá ficar no xilol por muito tempo. |
Antes de montar é necessário cortar o tecido em fragmentos muito pequenos e colocá-los sobre uma lâmina. Adicionar uma gota de xilol sobre o tecido para evitar que seque. Em seguida coloca-se uma gota de entelan sobre o tecido e este é colocado em uma lamínula. Deixar secar durante 15 min. e observar ao microscópio (usar objetiva de 100x com óleo de imersão).
Resultados
A interpretação dos resultados é baseada nas lesões do WSSV que são características nos tecidos de origem epidérmica e mesodérmica.
As lesões não afetam os tecidos de origem endodérmica (células epiteliais do hepatopâncreas e do intestino médio). Na fase inicial da infecção, os núcleos hipertrofiados (fixados com Davidson) mostram uma inclusão central acidofílica-roxa rodeada por uma zona não corada e de um anel basofílico (cromatina marginada). Esta é a inclusão conhecida como “Cowdry A”, também é observada em infecção com IHHNV. Em etapas mais avançadas, a inclusão central se expande, ocupando todo o núcleo hipertrofiado e se torna progressivamente mais basofílica. Para diagnosticar o WSSV, os melhores tecidos são o epitélio do estômago, o epitélio subcuticular e as brânquias.
Na figura abaixo é possível visualizar três tipos de núcleos: normais, infectados e tipo Cowdry A. Os núcleos normais são irregulares e com cromatina dispersa (manchas negras no interior). Os núcleos infectados são esféricos, de maior tamanho, com cromatina marginada (anel ao redor do núcleo e interior liso).
